Complejos metálicos de cobre y manganeso con ligandos biologicamente activos

Abstract

La tesis doctoral presentada tiene como objetivo general la síntesis y caracterización de complejos metálicos de Mn(II), Mn(III) y Cu(II) con sulfonamidas N-derivadas. Además del estudio químico de caracterización de los complejos obtenidos, se ha analizado su actividad biológica cuando actúan como agentes miméticos del enzima natural superóxido dismutasa y como nucleasas químicas. <br/>Los ligandos utilizados para las síntesis de los diferentes complejos han sido: <br/>4-amino-N-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)bencenosulfonamida (sulfametizol; Hsmtz), <br/>4-amino-N-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)bencenosulfonamida (sulfametazina; Hsmtzn),<br/>N-(tiazol-2-il)toluenosulfonamida (Htz-tol), N-(tiazol-2-il)bencenosulfonamida <br/>(Htz-ben) y N-(tiazol-2-il)naftalenosulfonamida (Htz-naf). Los dos primeros han sido adquiridos comercialmente, mientras que los últimos han sido sintetizados por primera vez para la realización de este trabajo.<br/> La caracterización de estos ligandos se ha realizado a través de las técnicas de análisis elemental, espectroscopía infrarroja y mediante difracción de rayos-X.<br/> Con estas sulfonamidas se han obtenido complejos binarios y ternarios de Mn(II), Mn(III) y Cu(II), con piridina o imidazol y derivados. Los complejos obtenidos han sido:<br/> <br/>Mn(smtz)2(py)2·4H2O <br/>Mn(smtz)2(imH)2·H2O <br/>Mn(smtz)2(N-metilimH)2·3H2O<br/>[Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2<br/> Mn(smtzn)2·3H2O <br/>&#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)]·(imH)&#61565;n <br/>Mn(smtzn)3·3H2O <br/>[Cu2(tz-tol)4]<br/>Cu(tz-tol)2(N-metilimH)2 <br/>Cu(tz-tol)2(4-metilimH)2 <br/> [Cu2(tz-ben)4] <br/> Cu(tz-ben)2(imH)2<br/> Cu(tz-ben)2(N-metilimH)2 <br/> [Cu2(tz-naf)4] <br/> Cu(tz-naf)2(N-metilimH)2 <br/> Cu(smtz)2&#61655;H2O <br/> [Cu(smtz)2(N-metilimH)2&#61655;H2O<br/>[Cu(smtz)2(imH)2]<br/>Cu(smtz)2(4-metilimH)2&#61655;3H2O<br/>[Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O<br/> Cu(smtzn)2&#61655;3H2O <br/>[Cu(smtzn)(imH)](NO3)&#61655;½H2O<br/>Cu(smtzn)2(N-metilimH)2&#61655;2H2O<br/>[Cu(smtzn)(4-metilimH)](NO3)&#61655;H2O <br/><br/>El estudio químico de caracterización de los complejos se ha realizado mediante las técnicas de análisis elemental, espectroscopía infrarroja (IR), espectroscopía electrónica, espectroscopía de resonancia paramagnética (RPE) y medidas magnéticas. Además se ha determinado la estructura cristalina de los compuestos [Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2, &#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)]·(imH)&#61565;n, [Cu(smtz)2(imH)2], [Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O, [Cu2(tz-tol)4] y [Cu2(tz-naf)4] <br/> <br/>El anión O2.-, producido como consecuencia del metabolismo celular, es mediador de enfermedades tan importantes como infarto agudo de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, apoptosis celular, cáncer, artritis o desórdenes neurológicos como las enfermedades de Parkinson o Alzheimer.<br/>Por ello, cabe suponer la existencia en la célula de ciertos mecanismos de defensa contra el daño provocado por la toxicidad de este radical. Entre estos mecanismos se encuentran los enzimas Superóxido Dismutasa (SOD), que catalizan la dismutación del superóxido (O2.-) para formar peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. <br/>Se conocen diferentes clases de enzimas SOD clasificados basándose en el metal que se encuentra en el centro activo del enzima y que participa en la catálisis. Así, encontramos los enzimas Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD y más recientemente Ni-SOD.<br/>Actualmente existen ciertos complejos metálicos que se comportan mimetizando la actividad de este enzima. En el presente trabajo se ha ensayado la actividad SOD que presentan los complejos obtenidos mediante métodos in vitro indirectos (Oberley y Spitz) y se ha desarrollado un nuevo método in vivo basado en la protección que ejercen los complejos frente al estrés oxidativo en diferentes cepas de la levadura S. cerevisiae. (Cepa salvaje: W303-1ª, cepa mutada: ATCC 96687, carente del gen que expresa el enzima Cu/Zn-SOD). Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que algunos de los complejos ensayados presentan actividad SOD ya que éstos han mejorado el crecimiento de la cepa de S. cerevisiae mutada carente de la Cu/Zn-SOD.<br/><br/>A continuación se ha estudiado la actividad nucleasa de los complejos, consistente en la determinación de su capacidad para escindir la cadena helicoidal de ADN. El ADN es el material genético de los organismos celulares. <br/>La capacidad que poseen los complejos para escindir la doble hélice del ADN mediante procesos de oxidación-reducción actuando como nucleasas químicas resulta de gran interés en el campo de la medicina y la biotecnología por el uso potencial de estos complejos metálicos como agentes antitumorales. <br/>La capacidad nucleasa de los complejos se ha determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.<br/>El ADN utilizado para los ensayos es plásmido pUC 18. Los plásmidos existen como moléculas cíclicas de ADN superenrollado. La rotura de una cadena hace que este estado superenrollado (forma I), se convierta en un estado simple cíclico relajado (forma II). Cuando se produce la rotura en la otra cadena de la doble hélice se obtiene la forma lineal del ADN (forma III). La forma I superenrollada migra más rápidamente que la forma II relajada. La forma III, lineal, migra en los geles de agarosa en una posición intermedia entre la formas I y la forma II.<br/>Se ha analizado el comportamiento electroforético, en geles de agarosa, del ADN tratado con los distintos complejos en diferentes tampones (TRIS-HCl, borato, cacodilato, etc.) y con diversos oxidantes y reductores (H2O2, ascorbato, oxone Na2S2O8, etc.). Se comprueba que son capaces de cortar el ADN y que son más activos como nucleasas que los metales que los forman. Mediante la técnica de AFM (Atomic Force Microscopy) se han confirmado los resultados obtenidos para el complejo Mn(smtzn)3·3H2O. <br/> Para algunos de los complejos se han realizado estudios de especificidad de corte al ADN, utilizando los enzimas de restricción EcoRI y Sca. Estos estudios han mostrado que los complejos ensayados no presentan corte especifico sobre el ADN.

The main objective of this doctoral thesis is the synthesis and characterization of metal complexes of Mn(II), Mn(III) and Cu(II) with N-substituted sulfonamides that present biological activity (SOD-like activity and nuclease activity). Five sulfonamides derivatives have been used for the synthesis of the complexes. <br/>The chemical characterization of the complexes has been carried out by elemental analysis, infrared spectroscopy, electronic resonance spectroscopy, electronic spectroscopy and magnetic measurements. Also, the crystal structures of the complexes [Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2, &#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)](ImH)&#61565;n, [Cu(smtz)2(imH)2], [Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O, [Cu2(tz-tol)4] and [Cu2(tz-naf)4&#61533; have been determined.<br/>The biological activity of the complexes as SOD mimics and as chemical nucleases has been assayed.<br/>The interest of complexes with SOD-like activity is due to their possible use in chemical therapy of diseases produced by free radicals generated in organism as subproducts of cellular metabolism. SOD-like activity of complexes has been tested by in vitro methods (Oberley and Spitz). Moreover, for determining this activity a new in vivo method based on the protection of the complexes against oxidative stress over diferent strains of S. cerevisae has been developed.<br/>The results obtained in vivo have shown that some of the complexes present SOD-like activity. They are able to improve the growth of the S. cerevisae mutant strain (&#916;sod1) which is defective in Cu/Zn-SOD.<br/>The capacity of complexes to cleave DNA acting as chemical nucleases has been studied too. This capacity is of great interest in medicine and biotecnology for the potencial use of these metal complexes as antitumoral agents. <br/>The nuclease activity has been determined by agarose gel electrophoresis. DNA was treated with the complexes in the presence of different reducting agents (H2O2, ascorbate, .) at different pH. The results have pointed out that some complexes are able to cleave supercoiled DNA to linear DNA.<br/>For the different complexes, specificity using restriction enzymes (EcoRI and Sca) and action mechanism have been investigated.