http://www.tdx.cat:80/handle/10803/16 Sat, 18 May 2013 17:09:11 GMT 2013-05-18T17:09:11Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/110928 Caracterización funcional del factor de transcripción ZmZIM91 de maíz Vélez Bermúdez, Isabel Cristina La subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa de CK2 de maíz fue usada como anzuelo para realizar un cribado mediante doble híbrido de una librería de cDNA, construida a partir de mRNA de hoja de maíz joven sometida a tres horas de deshidratación. Entre las proteínas que interaccionaron con CK2, fue identificado un factor de transcripción putativo llamado ZmZIM91 (Tipo GATA/Zinc Finger). La proteína ZmZIM91 no había sido anteriormente caracterizada en maíz y la información conocida de sus homólogos en Arabidopsis era muy escasa y no proporcionaban datos acerca de las funciones específicas de este grupo de proteínas. Estudios filogenéticos permitieron demostrar que ZmZIM91 pertenecía a la familia TIFY, más concretamente a la subfamilia ZML, a esta gran familia también pertenecen las proteínas JAZ, las cuales han sido muy estudiadas tanto en Arabidopsis como en otras especies. Con el fin de realizar una caracterización molecular de ZmZIM91, en primer lugar, se estableció que esta proteína era sustrato de la proteína quinasa CK2 de maíz, la cual regula a este factor de transcripción a través de fosforilación tanto bajo tratamientos de sequía como de Metil Jasmonato (MeJA). Por otra parte, fueron llevados a cabo experimentos de pull-down, doble híbrido y complementación Bimolecular, los cuales arrojaron resultados como la interacción de ZmZIM91 con la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2, la dimerización de dicho factor y la interacción con las proteína JAZ, sin embargo se estableció que a diferencia de los JAZ, ZmZIM91 no puede interaccionar con COI1. Por otra parte, se realizaron experimentos de western de hojas de maíz silvestres usando el anticuerpo contra la proteína endógena ZmZIM91 y de sobreexpresión en protoplastos de maíz con aplicación de la hormona MeJA, al igual que MeJA y MG132, donde se observó que ZmZIM91 era degradada en presencia de MeJA a una hora y que su degradación era a través de la vía del proteasoma 26S. Mediante un ensayo de Protein-Array, se logró establecer que ZmZIM91 se podía unir a ADN directamente a través de los motivos GATA y GATC. Ensayos de Inmunoprecipitación de la Cromatina y secuenciación masiva paralela (ChIP-Seq) en planta, permitieron determinar genes diana del factor de transcripción ZmZIM91, siendo dos de ellos el maize caffeic acid O-methyltransferase (COMT) implicado en la biosíntesis de lignina y el gen de la DFR (A1) involucrado en la biosíntesis de los flavonoides, estos resultados fueron confirmados a través de ChIP-QPCR, donde fueron detectados como altamente enriquecidos, además mediante un experimento de expresión transciente en protoplastos de maíz, se pudo determinar que el factor de transcripción ZmZIM91 es un represor de COMT y A1, sugiriendo que ZmZIM91 tiene un papel extendido en la ruta de los fenilpropanoides y que además es un regulador negativo de dicha ruta. Experimentos de inmunoprecipitación de la Cromatina (ChIP) con aplicación de tratamiento con MeJA a una hora, confirmaron que en presencia de esta hormona, ZmZIM91 pierde capacidad de unión a los promotores de COMT y A1. Por otra parte, a través de ensayos de complementación Bimolecular se estableció la interacción del factor de transcripción ZmZIM91 con los factores ZmMYB31 y ZmMYB42 implicados en la regulación negativa de genes de la ruta de los fenilpropanoides, con los cuales podría estar actuando como un módulo regulador sobre promotores de genes como ZmCOMT y ZmA1.; The regulatory subunit of protein kinase CK2β1 was used as a bait to perform a yeast two-hybrid screening against a cDNA library of drought-stressed maize leaves. Between the interacting partners a putative transcription factor named ZmZIM91 (GATA/Zinc Finger type) was identified. The protein ZmZIM91 has not been previously characterized in maize and there was little information about their homologous in Arabidopsis thus, no fuctional data regarding this group of proteins was available. Sequence analysis and phylogenetic studies show that ZmZIM91 belong to the TIFY family, more specifically at the ZML subfamily. JAZ proteins, which have been widely characterized in Arabidopsis and in other species, also belong to the TIFY family. To make a molecular characterization of ZmZIM91, first of all, it was demonstrated that this protein was an in vitro substrate of the maize protein kinase CK2. In addition, in vivo gel kinase assays suggest that phosphorylation regulates this protein under different treatments as drought or methyl jasmonate (MeJA). Furthermore, were carried out a set of experiments as pull-down, yeast two-hybrid assay and Bimolecular fluorescence complementation, which yielded results as the interaction between ZmZIM91 with the regulatory subunits of the protein kinase ZmCK2, the dimerization of ZmZIM91 and the interaction with JAZ protein, however, it was established that unlike JAZ, ZmZIM91 cannot interact with the E3 ubiquitin ligase COI1. Furthermore, were performed western blot experiments using wild-type maize leaves and the endogenous antibody against ZmZIM91 (produced in this work), also assays of overexpression in maize protoplasts in both using the MeJA hormone, as MeJA and MG132, where it was observed that ZmZIM91 was degraded in the presence of MeJA in one hour and its degradation it is probably through the 26S proteasome pathway. Using a Protein-Array assay, it was established that ZmZIM91 could bind to DNA directly through GATA and GATC motifs. Finally, experiments of chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing (ChIP-Seq), allowed to determine target genes of the transcription factor ZmZIM91. Between the targets identified, one correspond to the caffeic acid O-methyltransferase (COMT) gene, involved in the biosynthesis of lignin and another is the DFR gene (A1) involved in the biosynthesis of flavonoids. These results were confirmed by ChIP-QPCR, and by transient expression experiments in maize protoplasts where they were identified as highly enriched, It was determined that the ZmZIM91 transcription factor is a repressor of COMT and A1 genes, suggesting a regulatory role of ZmZIM91 in the phenylpropanoid pathway and also as a negative regulator of this pathway. Experiments Chromatin immunoprecipitation (ChIP) with MeJA treatment application at one hour, confirmed that in the presence of this hormone ZmZIM91 loses binding capacity to the COMT and A1 promoters. Moreover, through Bimolecular complementation assays was established the interaction between the transcription factor ZmZIM91 and the ZmMYB31 and ZmMYB42 factors involved in the negative regulation of genes of the phenylpropanoid pathway, which may be acting as a regulatory module to regulate genes such as COMT. Fri, 03 May 2013 10:23:04 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/110928 2013-05-03T10:23:04Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/110348 Regulation and actions mediated by C-jun N-terminal kinase pathaway Lanuza Masdeu, Jordi Es va generar un ratolí transgènic amb la capacitat d'activar JNK específicament al pàncrees. Tot i que aquests ratolins no tenen cap afectació morfoestructural en els seus illots pancreàtics ni diferències en el contingut total d'insulina però presenten intolerància a la glucosa i no secreten insulina en resposta a hiperglucèmia. A nivell molecular, les cèl•lules β pancreàtiques amb JNK activa, tenen un bloqueig a la via de senyalització d'insulina que fa que es redueixi la secreció d'insulina i l'expressió de gens diana de la insulina. El tractament amb rossiglitazona, un fàrmac del grup de les TZDs, aconsegueix revertir el fenotip in vivo. Tots aquests resultats indiquen que l'activació de JNK és suficient per promoure la resistència a insulina central però no n'hi ha prou per induir hiperplàsia dels illots o induir l'apoptosi de les cèl•lules β. A més a més, aquests ratolins estan protegits de la hiperinsulinèmia, la hiperglucèmia i l'obesitat induïdes per la dieta grassa o l'envelliment. També s'ha estudiat la interacció entre les vies de senyalització de JNK i NF-κB. Fins ara, s'ha va publicat que JNK pot induir l'activació de NF-κB mitjançant l'estabilització del mRNA de la βTrCP, responsable de la degradació d'IκBα. JNK va resultar fosforilar a CRD-BP, una proteïna que s'uneix al mRNA de βTrCP per protegir-li de l'atac per part del miR-183. A més, un mutant de βTrCP perquè no s'hi unís el miRNA, es seguia estabilitzant en resposta a l'activació de JNK a nivel de proteïna però no de mRNA. A part d'aquest efecte, JNK també aconsegueix estabilitzar SKP1 però la interacció SKP1-βTrCP és necessària per a una màxima estabilització. A més a més, aquest efecte podria ser extensiu a altres dianes de βTrCP com β-catenina i també estan afectades els nivells d'altres F-Box com la SKP2, i el dels seus substrats.; As a part of the research-line that deals with physiological and pharmacological (anti-inflammatory and/or anti-diabetic) actions conducted by some nuclear receptor (NR) ligands through negative interference with the c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway, this project is focused on studying the effects of the activation of JNK in a mouse model and evaluating the capacity of those ligands to recover the homeostasis. In parallel, there is a second project about the characterization of the crosstalk between the JNK pathway and NF-κB, another major pathway in inflammation. The relevance of the activation of JNK in a wide range of pathologies with an inflammatory component, lead the group to the generation of a transgenic mouse carrying a a constitutively active form of the MAP2K of JNK, MKK7, with a conditional expression upon the regulation of the Cre recombinase. Despite these mice have no morphostructural affectation of the pancreatic islets or differences in the total insulin content, they have defective glucose homeostasis showing glucose intolerance and decreased insulin secretion in response to hyperglycemia. This reduction in glucoseinduced insulin release is β cell autonomous, as it is reproduced in isolated islets, and JNK activity dependent, as it is reverted by the specific inhibitor of JNK, TAT-JIPi. At molecular level, β-cells with activated JNK have a blockage in the insulin-signaling pathway that reduces the secretion of insulin and the expression of insulin target genes. The treatment with rosiglitazone, an insulin-sensitizing drug of the thiazolidinedione family that inhibits JNK activation, restored insulin secretion in response to glucose in isolated islets and in vivo. All these data indicate that the activation of JNK is sufficient to promote central insulin resistance but is not sufficient to induce islet hyperplasia or β-cell death. Moreover, these mice are protected from basal plasma hiperinsulinemia caused by aging or high fat diet challenge. Regarding the second project, the interaction between NF-κB.and JNK pathways, both signaling pathways are essential for the regulation of the immune and inflammatory response as well as other fundamental processes such as cell proliferation and survival. It was published that JNK was activating NF-κB. pathway by inducing the mRNA stabilization of the E3 ubiquitin ligase βTrcP. We have further reported that JNK is targeting the miRNA183/CRD-BP system to stabilize βTrCP mRNA. At a protein level we have shown that SPK1-βTrCP complex formation is required for JNKdependent SKP1 and βTrCP protein stabilization. Not only this but the βTrCP substrate β‐catenin is down regulated by the JNK-dependent increase of βTrCP and the protein levels of SKP2 and its substrate p27 are oppositely regulated by JNK Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica (IRB) Wed, 17 Apr 2013 11:03:41 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/110348 2013-04-17T11:03:41Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/109040 A random approach to stabilize a membrane transport protein for crystallization studies / Un enfoque aleatorio para estabilizar un transportador de membrana para estudios de cristalización Rodríguez Banqueri, Arturo X-ray crystallography is, now at days, one of the most powerful techniques to study proteins at the atomic level. Unfortunately, obtaining high quality crystals of membrane proteins for x-ray diffraction is a difficult task due to the hydrophobic nature of these proteins. The low stability in solution of these proteins and their tendency to form aggregates are the biggest problems during crystallization studies. One of the most common strategies to overcome these problems consists on working with functional mutants of these proteins. It has been reported that single point mutations of key residues (normally within transmembrane segments) leads to a remarkable increase in the stability of some membrane proteins after detergent solubilization and extraction from the membrane. In addition, a single mutation can stabilize a specific conformer of the protein, decreasing its heterogeneity in solution. Despite this, predicting what mutations are going to improve the stabilization of a protein is virtually impossible. The main purpose of this thesis is to build up a medium-high throughput experimental protocol with the objective to generate and characterize random mutants of a membrane protein with more stability in detergent-solubilized solution and, therefore with a better probability to crystallize. The combination of random mutagenesis with rapid and sensitive screening protocols of protein expression and stability seems to be the best approach for this goal. The use of the green fluorescent protein (GFP) as reporter has enormously facilitated the studies of expression, purification and stability of a membrane protein. Also, with the aim of minimizing undesired effects of full-length GFP, we optimized an assay based on a split GFP to build and characterized the random mutants library. Specifically we focus on SteT, a Bacillus subtillis transporter that exchanges L-threonine by L-serine. SteT is an excellent prokaryotic model (30% of amino acid identity) of the mammalian L-amino acid transporter (LAT) family. Genetic mutations of some LATs are the direct cause of two types of aminoaciduries. Moreover, a member of this family, LAT1, is overexpressed in tumor cells, although the physiological role of this is still unknown. Unfortunately, SteT wild type solubility and stability in detergent solutions is very low and completely incompatible with crystallization tests. Our results suggest that random mutagenesis combined with the GFP split assay, appears to be an excellent strategy to build robustness in membrane proteins for structural studies. So far, using this strategy we found a mutant of SteT that currently is undergoing for crystallization screenings to study the structure and mechanism of mammalian LATs.; La cristalografía de rayos X es, hoy en día, una de las técnicas más potentes para el estudio de las proteínas a nivel atómico. Desafortunadamente, la obtención de cristales de alta calidad de proteínas de membrana para la difracción de rayos X es un desafío debido a la naturaleza hidrofóbica de estas proteínas. La baja estabilidad en solución de estas proteínas y su tendencia a formar agregados son los mayores problemas durante los estudios de cristalización. Una de las estrategias más comunes para superar estos obstáculos consiste en trabajar con mutantes funcionales de estas proteínas. Se han publicado estudios sobre mutaciones en residuos clave en proteínas de membrana (normalmente dentro de los segmentos transmembrana) que conducen a un notable incremento de la estabilidad en solución, previa extracción de la membrana y solubilización en detergente. Además, una sola mutación puede estabilizar un confórmero específico de una proteína, disminuyendo su heterogeneidad en solución. A pesar de esto, predecir qué mutaciones van a mejorar la estabilidad de una proteína es prácticamente imposible. El principal objetivo de esta tesis es la construcción de un protocolo de alto rendimiento experimental con el objetivo de generar y caracterizar mutantes aleatorios de una proteína de membrana que presenten una estabilidad adecuada después de solubilizar la proteína en detergente y, por lo tanto, con mejores garantías de cristalizar. Para conseguir estos objetivos hemos combinado técnicas de mutaciones aleatorias con métodos de cribaje rápidos y sensibles. En este sentido, el uso de la proteína fluorescente verde (GFP) ha facilitado enormemente los estudios de expresión y purificación de proteínas de membrana. Con el objetivo de minimizar los efectos no deseados de la GFP, se creó y optimizó un ensayo basado en la complementación de la GFP (GFP split system) con un fin doble: seleccionar y caracterizar los componentes de la librería de mutantes aleatorios. Este protocolo se ha puesto a punto con SteT, un intercambiador de L-serina por L-treonina de Bacillus subtilis. SteT es un excelente modelo procariota (30% de identidad de aminoácidos) de la familia de transportadores de mamíferos de amino ácidos L (LAT). Mutaciones congénitas de algunos LATs son la causa directa de dos tipos de aminoacidurias. Además, un miembro de esta familia, LAT1, se sobreexpresa en células tumorales, aunque el papel fisiológico es aún desconocido. Desafortunadamente, SteT tiene una muy baja solubilidad junto a un gran inestabilidad en detergente, propiedades totalmente incompatibles con estudios de cristalización. Nuestros resultados indican que la mutagénesis aleatoria combinada con el ensayo basado en el “GFP split system”, es una estrategia excelente para aumentar la estabilidad de proteínas de membrana en estudios estructurales. Utilizando esta metodología hemos encontrado un mutante de SteT que actualmente está siendo cristalizado. Estos estudios serán clave para conocer mejor la estructura y el mecanismo de la familia de transportadores de mamífero LAT. Mon, 08 Apr 2013 07:04:56 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/109040 2013-04-08T07:04:56Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/101464 Biosíntesi d’isoprenoides en bacteris i plantes. Aproximacions biotecnològiques Perez Gil, Jordi Els isoprenoides constitueixen una vasta família de compostos naturals que duen a terme una amplia varietat de funcions, moltes d’elles essencials, en els tres dominis de la vida. No obstant tots ells deriven d’una única molècula comú, el IPP (i el seu isòmer DMAPP) que es produeix a través de dues possibles rutes biosintètiques, la via del MEP i la via del MVA. La via MEP és la predominant en eubacteris mentre que la del MVA ho és en arqueobacteris, fongs i animals. En plantes coexisteixen les dues vies de forma compartimentalitzada. Aquesta distribució diferencial de les dues vies ha convertit la via MEP en una nova i prometedora diana per al disseny de nous antibiòtics (amb la FSM, un inhibidor específic de l’enzim DXR de la via MEP com a màxim exponent), molt necessaris en l’actualitat com a conseqüència de l’emergent resistència que han desenvolupat un gran nombre de microorganismes patògens a les drogues desenvolupades fins al moment. No obstant, tot i que el caràcter essencial dels isoprenoides fa que la seva síntesi es mantingui en tots els éssers vius la enorme plasticitat gènica, que es concentra especialment en bacteris, ha donat lloc a l’adopció d’estratègies alternatives tant a nivell d’enzims com metabòlits. Els carotenoides conformen una subfamília dintre dels isoprenoides de compostos derivats de la molècula parental de 40 carbonis, el fitoe, amb funcions que comprenen tant el metabolisme primari com el secundari. Es sintetitzen principalment en els plastidis de les plantes però també són produïts per alguns bacteris no fotosintètics i fongs. La seva creixent aplicació en la indústria ha fet molt atractiva l’aplicació de la biotecnologia per a la producció d’aquests compostos però per poder afrontar amb garanties aquest repte cal conèixer a fons els mecanismes que regulen a tots nivells la seva producció. Al llarg d’aquest treball s’ha combinat l’estudi dels aspectes bàsics i aplicats de la síntesi d’isoprenoides amb especial èmfasi en el paper de la via del MEP i la biosíntesi de carotenoides per proposar i avaluar estratègies de millora de la seva producció tant en bacteris com en plantes. El treball ha permès testar l’us d’enzims bifuncionals per millorar simultaniàment dos passos catalítics de la ruta carotenogènica tant en sistemes bacterians com en plantes. Es va analitzar l’efecte de la fusió de LCYE i LCYB (ε-ciclasa i β-ciclasa respectivament) en expressar-la en un sistema model carotenogènic de E.coli o en plantes transgèniques d’Arabidopsis thaliana obtenint-se resultats positius en el primer cas però no en el segon. Aquesta diferència posa de manifest la major complexitat dels sistemes vegetals. En aquesta línia es va explorar el possible paper addicional de la regulació post-transcripcional en el control del flux de la via del MEP utilitzant un mutant (rif18) obtingut en base a un escrutini de resistència a la inhibició per FSM. L’estudi va posar de manifest un nivell de regulació com a resultat de la integració i coordinació de la ruta MEP amb la resta del metabolisme de la planta especialment els metabolismes del sucre i de les hormones. Paral.lelament es va avaluar el paper que juguen individualment cada un dels enzims de la via MEP en el control del flux de la via en sistemes bacterians. L’estudi de la sobreexpressió de cada un dels gens en un sistema model carotenogènic de E.coli va posar de manifest el paper clau de DXS i la participació en menor mesura de DXR i HDR, resultats similars als descrits en Arabidopsis. Però, encara més important, va demostrar que uns nivells moderats de sobrexpressió dels enzims clau produeixen millors resultats en l’acumulació de productes finals. Complementariàment es va estudiar en profunditat el paper de HDS tant en bacteris com en plantes ja que havia estat descrit préviament com un possible punt de regulació diferencial entre els dos sistemes en base a les diferències observades en alineaments de seqüència. En cap dels dos casos un increment de l’activitat d’aquest enzim millorava l’acumulació de productes finals. Els dos passos identificats com a claus en la ruta MEP (DXS i DXR) es van escollir com a objectius sobre els que, aprofitant la plasticitat gènica i metabòlica dels bacteris, cercar noves activitats alternatives. Per DXS es van identificar dues proteïnes de E.coli (E1-PDH i DHBPS) que en patir mutacions puntuals adquirien la capacitat de complementar la deficiència de DXS. Per identificar activitats alternatives a DXR es va analitzar la presència d’homòlegs pels 7 gens de la via MEP en els genomes seqüenciats de microorganismes. Es va identificar un grup en els que hi eren presents tots ells excepte DXR. Utilitzant el genoma de Brucella abortus es va identificar una proteïna sense homologia amb DXR (DRL) capaç de suplir-ne l’absència i que defineix una nova família de proteïnes la funció de les quals era desconeguda. La seva caracterització va mostrar que catalitza la mateixa reacció amb propietats cinètiques similars a les descrites per DXR però amb diferències significatives, com una menor eficiència catalítica o una menor sensibilitat a la inhibició per FSM. L’estudi filogènetic de la família va posar de manifest l’existència de DRL vertaderes (amb activitat DXR) que s’agrupaven en un mateix clade filogenètic i DRL falses definint a l’hora tres classes de proteïnes. La cristal.lització i resolució de l’estructura tridimensional de la proteïna DRL de Brucella abortus va permetre un estudi estructural comparatiu observant-se diferències significatives respecte DXR especialment en el reordenament del centre actiu. A partir d’aquestes diferències es va hipotetitzar, en base a modelitzacions in silico, la possibilitat d’inhibir diferencialment els dos enzims. Aquesta possibilitat es va confirmar en estudis d’inhibició in vitro amb les proteïnes DXR de E.coli, i DRL de B.abortus recombinants purificades. Els α-fenil derivats de la FSM mostraven una capacitat d’inhibició de DXR en l’ordre nanomolar mentre que no mostraven cap efecte sobre DRL a concentracions de fins a 1 mM obrint la porta al disseny de nous antibiòtics de gran especificitat.; ISOPRENOIDS BIOSYNTHESIS IN BACTERIA AND PLANTS Isoprenoids are a vast family of natural compounds that perform a wide variety of biological functions, many of which are essential. However, they all derived from the universal intermediates IPP and its isomer DMAPP. Their biosynthesis occurs through two possible biosynthetic routes, the MEP and the MVA pathways. The MEP pathway is the exclusive source of IPP and DMAPP in eubacteria whereas the MVA pathway provides these precursors in archaea, fungi and animals. In plants, both pathways coexist in different subcelullar compartments. This distribution of isoprenoid biosynthetic pathways among the kingdoms has turned the MEP pathway into a promising new target for the design of new antibiotics (with FSM, a specific inhibitor of the enzyme DXR, as the main representative). Although isoprenoids are essential in all free-living organisms, tremendous plasticity among bacteria has led to the evolution of alternative biochemical strategies to produce these universal precursors. Carotenoids comprise a subfamily of C40 isoprenoid end products derived from a molecule of phytoene with functions in both primary and secondary metabolism. These are synthesized primarily in the plastids of plants but are also produced by some photosynthetic bacteria, fungi, and rarely in insects. The increasing use of carotenoids in the food, cosmetics and pharmaceutical industries as pigments, fragrances and nutraceuticals has galvanized their production through biotechnological applications. We have combined the study of basic and applied aspects of isoprenoid biosynthesis focusing on the role of the MEP pathway and carotenoid biosynthesis to suggest and evaluate strategies for improving their production in bacteria and plants. To this end, we have exploited the metabolic plasticity of bacteria to provide new biotechnological tools for carotenoid production. In the study, the use of bifunctional enzymes was tested to simultaneously improve two catalytic steps. As a proof of concept we analyzed the effect of chimeric LCYE-LCYB (ε-cyclase and β-cyclase, respectively) in a carotenogenic E. coli model system or in transgenic plants of Arabidopsis thaliana. The difference in the results highlights the major complexity of plant systems. In this direction, we studied the possible role of additional post-transcriptional regulation controlling the flow of the MEP pathway by using a mutant (rif18) isolated from a FSM-resistance screening. The study showed a higher level of regulation as a consequence of the integration and coordination with other metabolic pathways of the plant, especially the metabolism of sugars and hormones. We also evaluated the role of each of the individual enzymes of the MEP pathway in controlling the pathway flux in bacterial systems. Overexpresion of each individual gene in a carotenogenic E. coli model system highlighted the key role of DXS and to a lesser extent of the participation for DXR and HDR in driving flux through this pathway, in agreement with previous reports for Arabidopsis. Even more importantly, these results demonstrate that adjusted levels of overexpresion of the key enzymes produce better results in the accumulation of end products, the most relevant parameter for evaluating biotechnological strategies. Additionally, we further studied the role of HDS both in bacteria and plants. This enzyme had been previously postulated to have different regulatory roles in the two systems based on protein alignments. In both cases, an increase in enzyme activity does not affect the accumulation of end products. The identified key steps in the MEP pathway (DXS and DXR) were chosen as targets to search for new alternative activities taking advantage of the genetic and metabolic plasticity of bacteria. Two E.coli proteins which underwent change-of-function mutations in dxs or dxr deficient strains and acquired DXS activity were identified (DHBPS and PDH-E1). An alternative activity to DXR was identified by analyzing the sequenced genomes available from bacteria. A small group of microorganism contains homologous genes for all MEP pathway but DXR. Using the genome of Brucella abortus, a separate protein with no apparent homology to DXR (thereafter named DXR-like, or DRL) was identified. DRL defines a new family of proteins that catalyzes the first committed step of the MEP pathway. Characterization of the protein showed that it catalyzes the same reaction with similar kinetic properties as DXR albeit with significant differences in catalytic efficiency and lower sensitivity to inhibition by FSM. Phylogenetic and complementation studies of the family revealed the existence of true DRL (with DXR activity) grouped in the same phylogenetic clade. Crystallization and structural resolution of DRL from Brucella abortus allowed a comparative study. Significant differences to DXR were observed, in particular in the arrangement of the active site. Based on those differences and in silico modeling, the possibility to selectively inhibit either enzyme was hypothesized. In vitro inhibition studies using purified recombinant E. coli DXR and B.abortus DRL demonstrates that α-phenyl derivatives of FSM inhibit DXR in the nanomolar range while show no significant effect on DRL at a concentrations up to 1 mM. Those results open the door for the design of new highly specific antibiotics. The first tests in biotechnological applications comparing the ability of the three alternative proteins to replace the original DXS or DXR activities showed no improvement in performance. However, these proteins should be considered starting materials to continue the optimization of the new catalytic functions acquired using directed enzyme evolution methods in the laboratory. Tue, 05 Feb 2013 09:04:54 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/101464 2013-02-05T09:04:54Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96984 Asignación de nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en E. coli Ferreira Melo, Elaine La identificación de interacciones proteína-proteína en las células resulta de gran importancia para entender los procesos biológicos a nivel molecular. Así, cada vez despierta mayor interés el estudio de las proteínas, no de manera individual sino a través de las interacciones que establecen con otras proteínas o biomoléculas ya que estas asociaciones son fundamentales para el desarrollo de las funciones celulares. En este sentido, una gran parte de este trabajo se ha dirigido a la aplicación de metodologías que permiten identificar y evaluar interacciones proteína-proteína, con la finalidad de asignar nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en E. coli. Estudios realizados en humanos muestran que GAPDH es una proteína multifuncional, implicada en diversos procesos celulares. Las diferentes funciones dependen de su localización subcelular, estado oligomérico o interacciones con otras proteínas o ligandos. Sin embargo en bacterias, funciones alternativas a la glicólisis sólo se han descrito para la GAPDH secretada al medio extracelular por cepas patógenas y probióticas. El objetivo de este trabajo es contribuir a la identificación de nuevas funciones de GAPDH en E. coli a nivel intracelular mediante el estudio de las interacciones que establece con otras proteínas. Mediante experimentos de cross-linking in vivo seguidos de inmunoprecipitación y análisis por espectrometría de masas se han identificado varias proteínas implicadas en distintos procesos celulares. A través de ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha validado la interacción de GAPDH con EF-Tu, piruvato quinasa, triptofanasa, fosfoglicolato fosfatasa (PGPasa) y las subunidades α y β de la ATP sintasa. La diversidad de proteínas identificadas sugiere que GAPDH, a través de múltiples interacciones, podría estar participando o modulando procesos metabólicos, de transporte, síntesis de proteínas, obtención de energía y reparación de DNA. La implicación de GAPDH en procesos de reparación del DNA se ha evidenciado en estudios funcionales, utilizando células deficientes en esta proteína, en concreto mutantes knockout gapA o células silenciadas para la expresión del gen gapA mediante RNA antisentido. Se ha observado que estas células presentan una menor viabilidad que las control cuando son tratadas con agentes genotóxicos como bleomicina o metilmetanosulfonato. Además en el DNA genómico del mutante knockout gapA se observa un incremento en el número de centros abásicos generados de modo espontáneo. Mediante ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha evidenciado la interacción de GAPDH con proteínas que participan en los sistemas de reparación del DNA, como Endo IV del sistema de reparación por escisión de bases (BER) y SSB (single stranded DNA binding protein) implicada en los procesos de recombinación homóloga y en la respuesta SOS. Por último, las células deficientes en GAPDH (knockout y silenciadas) presentan morfología filamentosa en fase estacionaria de crecimiento, fenotipo sugerente de una inhibición de la replicación por acúmulo de mutaciones no reparadas.; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is considered a multifunctional protein with defined functions in numerous mammalian cellular processes. GAPDH functional diversity depends on various factors such as covalent modifications, subcellular localization, oligomeric state or intracellular concentration of substrates or ligands, as well as protein–protein interactions. In bacteria, alternative GAPDH functions have been associated with its extracellular location in pathogens or probiotics. In this study, new intracellular functions of Escherichia coli GAPDH were investigated following a proteomic approach aimed at identifying interacting partners using in vivo formaldehyde cross-linking followed by mass spectrometry. The identified proteins were involved in metabolic processes, protein synthesis and folding or DNA repair suggesting involvement of GAPDH in many cellular processes. Some interacting proteins were also identified in immunopurification experiments in the absence of cross-linking. Among the proteins identified as potential GAPDH interacting partners, we found the interaction with PGPase to be of special interest due to its physiological role in processes linked to DNA repair. This enzyme is involved in the metabolism of 2-phosphoglycolate formed in the DNA repair of 3’-phosphoglycolate ends generated by bleomycin damage. We show that PGPase-GAPDH interacting complexes increased in cells challenged with bleomycin, suggesting involvement of GAPDH in cellular processes linked to DNA repair mechanisms. The functional implication of GAPDH in DNA repair was evidenced in GAPDH deficient strains (gapA knockout mutants or conditional silencing of gapA gene by antisense RNA) following different approaches: (i) GAPDH deficient cells presented lower viability with respect to wild type cells when treated with bleomycin or the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS); (ii) The gapA mutant showed increased number of spontaneous apurinic / apyrimidinic (AP) sites in its DNA genomic; (iii) Pull-down experiments followed by Western Blot showed interaction of GAPDH with endonuclease IV (Endo IV), a protein involved in the repair of AP sites and with the single-stranded DNA binding protein (SSB), essential for DNA repair induced under conditions of SOS response. Finally, (iv) GAPDH deficient cells presented a filamentous morphology in stationary phase, phenotype that suggests an inhibition of cellular division, probably due to accumulation of unrepaired mutations as a consequence of GAPDH deficiency. Mon, 07 Jan 2013 11:00:33 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96984 2013-01-07T11:00:33Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96820 Role of the Kinases NEK6, NEK7 and NEK9 in the Regulation of the Centrosome Cycle Sdelci, Sara This thesis project is focused on the study of the signaling module formed by the NIMA-related protein Nek6, Nek7, and Nek9 and their function during early mitosis, with particular interest in centrosome separation and maturation. Nek9/Nercc1 was identified by Dr. Joan Roig. Nek9 is expressed in all cell lines and tissues studied is inactive during interphase while during mitosis is activated through phosphorylation by Plk1 which is in fact able to bind Nek9 and subsequently phosphorylates Nek9 on its activation loop. During mitosis Nek6 and Nek7 bind the C-terminal of Nek9. Once active, Nek9 can phosphorylate Nek6 and Nek7, thus activating them. Active Nek9 localizes at centrosome, suggesting that Nek9/Nek6-7 has important functions in the organization of microtubules during cell division. Confirming this idea, it has been shown that the microinjection of anti-Nek9 module induces arrest in prometaphase with disorganized spindle structures and misaligned chromosomes, or leads to abnormal mitosis resulting in aneuploidy. In the same direction, interference with the function of Nek7 or Nek6 leads to abnormal mitotic progression and spindle formation. We described how the Nek9/Nek6-7 module could provide a link connecting Plk1 and Eg5 in the context of centrosome separation. we analyzed the effects of Plk1, Eg5, Nek9, Nek6 or Nek7 down-regulation by RNAi on the extent of separation of duplicated centrosomes in prophase cells and we observed how this downregulation was affecting centrosome separation. We determine whether the activation of Nek9 or Nek6 could induce centrosome separation trasfecting cells with the active form of these two kinases; a considerable amount of cells that were in interphase shown separate centrosome demonstrating that Nek9/Nek6 are sufficient to induce centrosome separation. To test whether active Nek9 and Nek6 exerted their effect through the regulation of Eg5 we simultaneously transfected the cells with Eg5 siRNAs and we completely lost the centrosome separation described above. We demonstrated by immunofluorescence that the key event during centrosome separation was the recruitment of Eg5 at centrosomes and that the down-regulation of Plk1, Nek6, Nek7 or Nek9 resulted in prophase cells with unseparated centrosomes because Eg5 was not properly recruited. To prove whether the phosphorylation on Ser-1033 controls the accumulation of Eg5 to centrosomes and centrosome separation during early mitosis we transfected cells with wild type Eg5 or Eg5 S1033A; the wild type form of the kinesin was able to localize at centrosome and rescue the normal phenotype while Eg5 S1033A was not able to localize and resulted in cells delayed in mitosis. Plk1, the Nek9 activator, is involved in the regulation of centrosome maturation during early mitosis. Centrosome maturation refers to the process through which centrosomes increase size and microtubule nucleation activity and requires the accumulation of γ-TuRC complexes at centrosome. This recruitment depends on Nedd1 that acts as γ-Tubulin targeting factor. Plk1 depletion prevents accumulation of Nedd1 at centrosome. Our experiments show the importance of Nek9 in the regulation of centrosome maturation downstream of Plk1. Depletion of Nek9 by siRNA determined a decrease of γ-Tubulin and Nedd1 at centrosome. Further we investigated the upstream role of Plk1 depleting Plk1 and trasfecting active Nek9 and it was able to rescue the normal phenotype. Nek9 can interact with Nedd1 during mitosis and phosphorylates it provoking its accumulation at centrosome. The no-phosphorylable form of Nedd1 was not able to accumulate at centrosome and support the accumulation of γ-Tubulin there, determining a delay of the cells in prometaphase. Our results show that Nek9 is the link between Plk1 activity and the recruitment of Nedd1 to the centrosome and that the pathway formed by Plk1/Nek9/Nedd1 can be a key element in the control of mitotic centrosome maturation. Wed, 19 Dec 2012 11:45:11 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96820 2012-12-19T11:45:11Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96417 Hyperactivation of the TGF-β signaling pathway in glioblastoma: mechanisms and consequences Rodón Ahnert, Laura The TGF-β pathway is currently considered a therapeutic target in advanced tumors, including glioblastoma (GBM), and several anti-TGFβ agents are in clinical trials and have shown promising results .A thorough understanding of the molecular mechanisms involved in the protumorigenic function of TGF-β will facilitate the identification of markers of response that can be used to stratify patients to be treated with anti-TGFβ compounds and, moreover, will allow for the discovery of new therapeutic agents. TGF-β is highly active in high-grade glioma, and elevated TGF-β activity confers poor prognosis. Aberrant activation of TGF-β is caused in part by enhanced secretion of the TGF-β ligands by tumor cells and tumor stroma cells. However, the precise mechanisms that lead to the hyperactivation of the TGF-β pathway are not yet fully understood. In this work, we have demonstrated that the TGF-β signaling pathway can be hyperactivated in GBM by different means including the stabilization of the TβRI by overexpression of the deubiquitinating enzyme USP15 or the enhanced secretion of TGF-β2 by the generation of a malignant autocrine loop via CREB. In this project, we identified USP15 and CREB as two novel regulators of TGF-β activity. USP15 and CREB could be considered as markers of response to anti–TGF-β molecules and potential therapeutic targets against GBM.; La vía de señalización de TGF-β es una diana terapéutica en tumores avanzados tales como glioblastoma (GBM). Diversos fármacos anti-TGF-β están siendo evaluados en ensayos clínicos y muestran resultados esperanzadores. En GBM, la vía de señalización de TGF-β se encuentra hiperactivada y es factor de mal pronóstico ya que promueve invasividad, angiogénesis, metástasis, inmunosupresión e induce la auto-renovación de las “células iniciadoras de glioma”. La hiperactivación de la vía de señalización de TGF-β en GBM en parte está causada por un aumento de la secreción por parte de las células tumorales y las células del estroma de los ligandos de TGF-β. Sin embargo, los mecanismos precisos que originan la hiperactivación de la vía de señalización de TGF-β en GBM son aún ampliamente desconocidos. En este trabajo, hemos descrito dos nuevos mecanismos moleculares que dan lugar a una hiperactivación de la actividad TGF-β en GBM, tales como la estabilización de TβR-I debido a la sobre-expresión de la deubiquitinasa USP15 o la sobre-expresión de TGF-β2 debido a la generación de un ciclo maligno autocrino mediado por el factor de transcripción CREB. En este proyecto, hemos identificado USP15 y CREB como dos nuevos reguladores de la actividad TGF- β. Nuestros resultados sugieren que tanto USP15 como CREB podrían ser evaluados como dos nuevos marcadores de respuesta a fármacos anti-TGF-β y nuevas dianas terapéuticas contra GBM. Tue, 11 Dec 2012 11:49:47 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96417 2012-12-11T11:49:47Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96415 Study of the phosphorylation and activation of the protein kinase NEK9 during mitosis Bertran Domingo, M. Teresa Nek9 is a NIMA-related kinase that is phosphorylated in mitosis and a small pool of it (5%) is activated at the centrosomes by a complex mechanism which has remained elusive until now. Nek6 and Nek7 bind to the C-terminal tail of Nek9 and are directly phosphorylated and activated by Nek9, thus forming with Nek9 a signalling cassette of mitotic kinases. Once active, Nek6 and Nek7 phosphorylate the kinesin Eg5 at the Ser1033, a residue that has been shown to be important for mitotic progression. We have described that Nek9 is activated by a two-step mechanism, first by the phosphorylation of Cdk1, which leads to the binding of Plk1 through its PBD domain and further phosphorylation of Plk1 at different sites, including the activation loop at the Thr210. We show that both phosphorylation by Cdk1 and Plk1 are necessary for the activation of Nek9 in vivo. Results in our group demonstrate that active Nek9 and Nek6 induce centrosome separation in an Eg5-dependent manner, and also that active Nek9 and Nek6 can rescue Plk1 but not Eg5 downregulation in prophase centrosome separation. This work has demonstrated that Nek9 activation by Plk1 is necessary for the phosphorylation of the kinesin Eg5 at the Ser1033, and that this phosphorylation is necessary for prophase centrosome separation and Eg5 recruitment. During the last years we have inhibited Nek9 using different approaches, but in order to have an acute inhibition of the kinase we decided to take a chemical genetic approach. As a general overview, the strategy consists on doing a functionally silent mutation in the ATP binding pocket (gatekeeper residue) of the target kinase that sensitizes it to inhibition by an ATP analog and that does not inhibit wild type kinases. So far I have identified the gatekeeper residue of Nek9 and have been able to find a mutant that acts as an analog sensitive mutant in vitro.; Nek9 és una quinasa de la família de les NIMA que és fosforilada en mitosis i una petita part d’aquesta és activada als centrosomes mitjançant un mecanisme complex desconegut fins a ara. Nek6 i Nek7 són dues proteïnes de la mateixa família, que s’uneixen a la cua de Nek9 i que són fosforilades i activades directament per la fosforilació de Nek9, formant d’aquesta manera una casset de quinases mitòtiques. Una vegada actives, Nek6 i Nek7 fosforilen la quinesina Eg5 al residu Ser1033, residu que s’ha descrit que és important per una correcta progressió de la mitosis. En aquest treball hem descrit que Nek9 és activada mitjançant un mecanisme de dos passos, en el qual primer és fosforilada per Cdk1, que permet la unió de Plk1 mitjançant el seu domini PBD i posteriorment és fosforilada per Plk1 a diferents llocs, incloent el llaç d’activació a la Thr210. Demostrem que les fosforilacions tant per part de Cdk1 i Plk1 són necessàries per l’activació de Nek9 in vivo. Resultats del nostre grup demostren que Nek9 activa i Nek6 indueixen la separació dels centrosomes en profase de manera dependent d’Eg5, i també que Nek9 activa i Nek6 poden recuperar la separació dels centrosomes causades per una downregulació de Plk1, però no la produïda per la downregulació d’Eg5. Aquest treball demostra que l’activació de Nek9 per part de Plk1 és necessària per la fosforilació d’Eg5 a la Ser1044, i que aquesta fosforilació és necessària per la separació dels centrosomes en profase i pel reclutament d’Eg5 als centrosomes. Durant els últims anys hem inhibit Nek9 utilitzant diversos enfocs, però per tal d’obtenir una inhibició de la quinasa de forma aguda vàrem decidir seguir un “chemical genetic approach”. Aquesta estratègia consisteix en fer mutacions funcionalment silencioses en la butxaca d’unió de l’ATP (gatekeeper residue) que la sensititza per la inhibició mitjançant un anàleg d’ATP que no inhibeix la forma salvatge de la quinasa. Fins al moment, hem identificat el residu gatekeeper de Nek9 i hem pogut demostrar que aquest mutant actua com un mutant sensitiu a l’anàleg d’ATP in vitro. Tue, 11 Dec 2012 10:46:44 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96415 2012-12-11T10:46:44Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96130 Identificación de nuevos genes diana del receptor nuclear FXR Pedraz Cuesta, Elena Las sales biliares son cruciales para la solubilización y absorción en el intestino de las grasas y las vitaminas liposolubles procedentes de la dieta. Estas sales biliares son sintetizadas a partir de colesterol en los hepatocitos, lo que representa la mayor vía de eliminación de colesterol del cuerpo. Además de este importante papel fisiológico, las sales biliares también actúan como moléculas de señalización endocrina que afectan a múltiples órganos. Para ejercer estos efectos, los ácidos biliares se unen al receptor de membrana TGR5 (G protein-coupled bile acid receptor 1) y al receptor nuclear FXR (Farnesoid X receptor). Este receptor nuclear es capaz de regular la síntesis de ácidos biliares, inhibiendo la expresión de una enzima clave para su síntesis. FXR también regula genes implicados en el transporte de estos ácidos biliares hacia el exterior de la célula, no solo a nivel hepático sino también intestinal. Por todo esto se considera que FXR es un sensor de los ácidos biliares en el contexto enterohepático. Además del papel crucial que desarrolla FXR en la homeostasis de los ácidos biliares, también está involucrado en la regulación del colesterol y en el metabolismo de lípidos y glucosa. Estudios recientes han demostrado la participación de FXR en nuevas funciones relacionadas con procesos biológicos como la regeneración hepática (Huang W et al, 2006) y la inhibición de la progresión tumoral (Yang F et al, 2007; Modica S et al, 2008). La identificación de la expresión de este receptor nuclear en tejidos vasculares ha relacionado a FXR con enfermedades tan extendidas como la aterosclerosis (Bishop-Bailey, 2004). Por todo esto, FXR se ha convertido en una esperanza terapéutica en la lucha contra múltiples enfermedades. Se han empleado aproximaciones genómicas y farmacológicas con el objetivo de identificar nuevos genes diana humanos del receptor nuclear FXR. Los experimentos realizados con micromatrices en diferentes tejidos, donde la expresión de FXR está reportada, han permitido cumplir dicho objetivo. Por otro lado, los numerosos experimentos de biología molecular llevados a cabo han confirmado los resultados obtenidos y han permitido caracterizar los mecanismos de regulación que ejerce FXR sobre los nuevos genes humanos identificados. La investigación realizada ha evidenciado que FXR regula genes involucrados en el transporte de ácidos grasos y retinol, así como en la ubiquitinación, el transporte vesicular o la supervivencia celular. De la misma manera, se ha descubierto la regulación por FXR de genes asociados a enfermedades como la inflamación, el alcoholismo, la litiasis o el cáncer.; Bile salts are crucial for the solubilization and absorption in the intestine of fats and vitamins from the diet. These bile salts are synthesized from cholesterol in hepatocytes, which represents the major route of elimination of cholesterol from the body. Besides this important physiological role, bile salts also act as signaling molecules that affect multiple endocrine organs. To exert these effects, bile acids bind to the membrane receptor TGR5 (G protein-coupled bile acid receptor 1) and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X receptor). This nuclear receptor is able to regulate the bile acid synthesis by inhibition of a key enzyme for its synthesis and regulation of genes involved in the transport of bile acids to the outside of the cell, in the liver and intestine. By all this FXR is considered a bile acid sensor in the enterohepatic context. On the other hand, recent studies have shown the involvement of FXR in new functions related to biological processes such as liver regeneration (Huang W et al, 2006) and inhibition of tumor progression (Yang F et al, 2007; Modica S et al, 2008). The identification of the expression of FXR in vascular tissues it has been associated with diseases such as atherosclerosis (Bishop-Bailey, 2004). For all this, FXR has become a therapeutic hope in the fight against multiple diseases. Genomic approaches have been employed with the pharmacological target and identify novel human target genes of FXR. The microarrays in different tissues, where expression of FXR is reported, have allowed us to get this objective. Furthermore, molecular biology experiments carried out have confirmed the results obtained and allowed characterize the mechanisms of regulation exerted on new human target genes. Research has shown that FXR regulates genes involved in the transport of fatty acids and retinol, ubiquitination, vesicular transport or cell survival. Similarly, it has been discovered regulation by FXR of genes associated with diseases such as inflammation, alcoholism, lithiasis or cancer. Wed, 28 Nov 2012 11:13:17 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96130 2012-11-28T11:13:17Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96129 Estudio nutrigenómico de compuestos polifenólicos del cacao y del café en células tumorales humanas Oleaga Sancho, Carlota La investigación en genómica nutricional combina las áreas de conocimiento de biología molecular, genética y nutrición. Los compuestos bioactivos de la dieta se podrían definir como aquellos componentes con potencial para modificar un elevado número de procesos biológicos asociados al equilibrio entre salud y enfermedad. En la presente tesis se han desarrollado tres estudios nutrigenómicos con compuestos polifenólicos del cacao y del café, con el objetivo de profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción por los que ejercen su actividad. En el estudio de los efectos de un extracto de polifenoles de cacao (PCE) en líneas celulares de cáncer de mama, las conclusiones obtenidas son las siguientes: 1. El tratamiento con PCE induce la expresión de CYP1A1, así como sus niveles de proteína y la actividad enzimática en dos líneas celulares de cáncer de mama, MCF-7 y SKBR3. 2. La inducción de CYP1A1 mediada por PCE tiene lugar a través de la vía de señalización de AhR. PCE induce la transcripción de CYP1A1 a través de la unión de AhR a las cajas XRE de su promotor en ambas líneas celulares. 3. PCE induce los niveles de ERα en la línea celular SKBR3 aumentando la síntesis de la proteína, pero su vida media se reduce aproximadamente 10 horas en comparación con la proteína basal. 4. La incubación con PCE y tamoxifeno (TAM) a concentraciones no citotóxicas inducen un efecto sinérgico provocando un descenso en la viabilidad de dos líneas de cáncer de mama, MCF-7 y SKBR3, pero no en la línea no tumoral HEK293T. En el análisis de los efectos de distintos metabolitos del cacao sobre la expresión de la apolipoproteína A1 en la línea celular HepG2 de hepatoma, establecimos las siguientes conclusiones: 1. La epicatequina (EPI) y los metabolitos del cacao inducen la expresión de ApoAI en la línea celular HepG2. 2. El tratamiento con EPI en células HepG2 induce la unión de factores de transcripción a dos regiones del “liver specific enhancer”, Site A y Site B. En la unión a Site A participan los factores de transcripción HNF-4, RXRα y ERα, además de HNF3β de manera indirecta. En la unión a Site B participa el factor de HNF-3β. EPI y los metabolitos del cacao estudiados inducen los niveles de mRNA de HNF-3β. 3. La transcripción de ApoAI se induce por EPI y los metabolitos del cacao estudiados a través del Site B, siendo 3-M-EPI el metabolito que provoca una mayor activación transcripcional. 4. Los factores de transcripción NFY y Sp1, además de HNF-3β, participan en la unión al Site B inducida por la incubación con 3-M-EPI. La sobreexpresión de NFY y Sp1 induce la transcripción de ApoAI a través del Site B. Finalmente en la aproximación transcriptómica en células de cáncer de colon tratadas con ácido cafeico y café soluble, podemos concluir que: 1. El tratamiento con ácido cafeico (CA) y con café (ICC) genera un cambio en el perfil de expresión de la línea tumoral HT29. 2. Se han identificado dos genes nodo, STAT5B y ATF-2, tras la generación de una red de asociación biológica a partir de los genes diferencialmente expresados comunes a ambos tratamientos, CA e ICC. 3. La validación de los cambios en la expresión de ambos genes confirma la sobreexpresión de STAT5B e infraexpresión de ATF-2 inducida por la exposición a CA e ICC. También se ha confirmado el aumento en la proteína STAT5B inducida por el tratamiento con CA y con ICC y la disminución de los niveles de ATF-2 debidos al tratamiento con CA. 4. El tratamiento con CA e ICC modula los niveles de ciclina D1, proteína regulada por STAT5B y ATF-2 en dos líneas celulares de cáncer. En HT29, la exposición a CA reduce los niveles de ciclina D1, mientras que ICC induce los niveles de ciclina D1 al igual que los de ATF-2. En MCF-7 ambos tratamientos, CA e ICC, consiguen una disminución drástica de los niveles de proteína ciclina D1, a pesar de no acompañarles la disminución de ATF-2.; NUTRIGENOMIC STUDIES OF COCOA AND COFFEE POLYPHENOLS IN HUMAN TUMOR CELL LINES Nutritional genomics research combines the knowledge areas of molecular biology, genetics and nutrition. Nutrigenomics studies how diet, or compounds from diet are able to modulate gene expression. Diet compounds such as polyphenols are known to produce beneficial effects in human homeostasis. Cocoa and coffee are two polyphenol food sources well studied in nutritional research. The aim of this work was to get further insight in the understanding of the mechanism of action through which cocoa and coffee polyphenols exert their beneficial effect, using three different nutrigenomics approaches. The main conclusions of these nutrigenomic studies are: 1) The interaction between ERα and AhR upon incubation with a polyphenolic cocoa extract leads to CYP1A1 induction in breast cancer cells. The synergy between PCE and non-cytotoxic tamoxifen concentrations opens the possibility for a combination therapy based on polyphenols from cocoa that increased tamoxifen efficacy. 2) The activation of Apolipoprotein AI transcription through Site B in its promoter by cocoa flavanol metabolites is mainly mediated by an increase in HNF-3β, with a significant contribution of Sp1 and NFY, as a mechanism for the protective role of these compounds in cardiovascular diseases. 3) Coffee polyphenols are able to affect cyclin D1 expression in cancer cells through the modulation of STAT5B and ATF-2. The results of this thesis led to three publications in international journals; i) “CYP1A1 is overexpressed upon incubation of breast cancer cells with a polyphenolic cocoa extract” in European Journal of Nutrition ii) “Cocoa flavanol metabolites activate HNF-3β, Sp1 and NFY mediated transcription of Apolipoprotein AI in human cells” in Molecular Nutrition and Food Research iii) “Coffee Polyphenols Change the Expression of STAT5B and ATF-2 Modifying Cyclin D1 Levels in Cancer Cells” in Oxidative Medicine and Cellular Longevity. Tesi realitzada conjuntament amb el Departament de Nutrició i Bromatologia Wed, 28 Nov 2012 10:29:31 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96129 2012-11-28T10:29:31Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96118 Metabolismo lipídico en "Arabidopsis thaliana": Caracterización de mutantes "arv" y de las isoenzimas farnesildifosfato sintasa citosólicas Ana Verónica Beatriz Keim 2012 Keim, Ana Verónica Beatriz Los estudios realizados sobre las proteínas Arv indican que estaría involucrada en la regulación de la homeostasis de esteroles y esfingolípidos. En levadura se observó una posible función en la síntesis de GPI (Kajiwara et al., 2008) y respecto a su topología, posee 3 dominios hidrofóbicos con el extremo N-terminal orientado hacia el citosol (Villasmil y Nickels 2011). En plantas, se caracterizaron los genes AtARV1 y AtARV2 de Arabidopsis thaliana que codifican dos proteínas de RE funcionales, AtArv1 y AtArv2. Estas comparten una identidad del 66% entre sí y poseen un dominio N-terminal AHD muy conservado en diferentes especies. Ambos genes poseen patrones solapantes de expresión en tejidos meristemáticos, excepto en hojas donde AtARV2 no se expresa (Forés et al., 2006). En este trabajo se determinó que AtArv1 posee un número par de dominios hidrofóbicos y que los extremos N- y C-terminales están orientados hacia el citosol. Además, se caracterizaron mutantes simples con pérdida de función (arv1) y dobles (arv1:arv2), que si bien no mostraron alteraciones fenotípicas, la activación de un RNAi en los doble mutantes arv1:arv2 indica que la pérdida de AtArv produce alteraciones fenotípicas en plántulas, que presentan acortamiento de la raíz y de los cotiledones que se vuelven amarillentos y se curvan en forma de « punta de flecha ». Los niveles de esteroles disminuyen y se ven incrementadas algunas BECL (Bases Esfingoides de Cadena Larga). Por otro lado, AtArv1 no parece estar vinculada a la UPR (Unfolded Protein Response) y su pérdida no es capaz de activar esta respuesta. La farnesildifosfato sintasa (FPS) es una enzima dimérica que cataliza la condensación de una molécula de dimetilalildifosfato con dos moléculas de isopentenildifosfato para dar lugar a farnesildifosfato, que es el punto de partida para la síntesis de isoprenoides en el citosol y las mitocondrias. Los genes FPS1 y FPS2 de Arabidopsis thaliana codifican las isoenzimas FPS1L mitocondrial), FPS1S y FPS2. Las secuencias aminoacídicas de FPS1S y FPS2 poseen una identidad del 90.6% y difieren en sólo 32 aminoácidos. El gen FPS1 se expresa de forma generalizada durante todo el desarrollo de la planta, en cambio, FPS2 muestra un patrón de expresión restringido a órganos florales, semillas y estadios tempranos de la germinación. En la caracterización de los mutantes nulos de Arabidopsis fps1 y fps2 se observó que el gen FPS2 es más importante en las semillas y las etapas tempranas de la germinación. La isoenzima FPS2 contribuye entre un 70-80% a la actividad FPS total en semillas maduras. Como consecuencia, las semillas del mutante fps2 presentan niveles reducidos de sitosterol, un aumento de la actividad HMG-CoA reductasa (HMGR) e hipersensibilidad a la mevastatina (Closa et al., 2010). En este trabajo se ha determinado mediante ensayos bioquímicos, que la isoenzima FPS2 es catalíticamente más eficiente, más sensible al efecto inhibitorio del NaCl, y termodinámicamente más estable que FPS1S. También se ha demostrado la localización citosólica de ambas isoenzimas. Los patrones de expresión de los genes FPS1 y FPS2 son complementarios en semilla e indican que el FPP necesario para el desarrollo de las semillas tiene dos posibles orígenes separados en el espacio y en el tiempo. Por último, los estudios de complementación funcional en semillas del mutante fps2 demuestran que en condiciones normales FPS1S y FPS2 son funcionalmente intercambiables.; The previously characterized Arabidopsis thaliana proteins AtArv1 and AtArv2 have been suggested to be involved in the regulation of cellular lipid homeostasis as demonstrated for their yeast and mammalian counterparts. In this study, we established the citosolic orientation of both N- and C-terminal ends of the AtArv1 protein in the yeast ER membrane. Functional complementation assays of an arv1Δ yeast strain with a truncated AtArv1 protein also showed that the C-terminal 31 aminoacids are essential for AtArv1 function. Characterization of single Arabidopsis arv mutants did not reveal any effect on plant phenotype. On the contrary, characterization of loss-of-function Arabidopsis arv1:arv2 double mutants obtained by inducible siRNA-mediated silencing of AtARV genes demonstrated that lack of AtArv function leads to reduced root lenght and pale green curved cotiledons as well as to reduced levels of major sterols and increased levels of some sphingolipid LCBs (Long Chain Bases). In contrast to S. cerevisiae Arv1p, AtArv is not involved in the UPR (Unfolded Protein Response) in Arabidopsis since lack of AtArv1 does not activate this response. Previous results obtained in our laboratory showed that Arabidopsis thaliana contains two genes encoding farnesyl diphosphate (FPP) synthase (FPS), the short-chain prenyl diphoshate synthase that catalyzes the synthesis of FPP from isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP). The FPS1 gene is widely expressed in all plant tissues throughout development, whereas FPS2 shows a pattern of expression restricted to specific floral organs, developing and mature seeds. Characterization of fps single knock-out mutants suggested that FPS2 has a major role in seeds and during the early stages of seedling development. Actually, FPS2 provides 70-80% of total FPS activity in mature Arabidopsis seeds, hence lack of FPS2 activity in seeds leads to a marked reduction in sitosterol content and a positive feedback regulatory response of HMG-CoA reductase (HMGR) activity that renders seeds hypersensitive to mevastatin. In this study, we provide evidence that the two Arabidopsis short FPS isozymes FPS1S and FPS2 localize to the cytosol. Biochemical characterization of these recombinant enzymes expressed in E. coli, revealed that, despite FPS1S and FPS2 share more than 90% amino acid sequence identity, FPS2 is more efficient as a catalyst, more sensitive to the inhibitory effect of NaCl, and more resistant to thermal inactivation than FPS1S. Expression analysis of FPS::GUS genes in seeds also showed that FPS1 and FPS2 display complementary patterns of expression particularly at late stages of seed development, which suggests that developping Arabidopsis seeds have two spatially segregated sources of FPP. Functional complementation studies of the fps2 knock-out mutant seed phenotypes demonstrated that at least under normal conditions FPS1S and FPS2 are functionally interchangeable. Tue, 27 Nov 2012 10:22:54 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/96118 2012-11-27T10:22:54Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/94194 Caracterización funcional y regulación de los sistemas génicos implicados en el metabolismo de alantoina en "Klebsiella pneumoniae" Guzmán López, Karla Este estudio se enfoca en el metabolismo de alantoina, y su derivado alantoato, como fuentes de nitrógeno en la enterobacteria “Klebsiella pneumoniae”. Los genes implicados en dicho metabolismo están agrupados en dos clusters diferentes. La primera agrupación denominada “hpxSAB-hpxC-guaD”, contiene los genes implicados en la degradación de alantoina a alantoato y el gen que codifica guanina desaminasa. En la segunda agrupación se encuentran los genes hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ que están implicados en el metabolismo de alantoato. El sistema hpxSAB-hpxC-guaD está formado por tres unidades transcripcionales de las cuales hpxC y hpxSAB se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad σ(70) de la RNA polimerasa mientras que guaD presenta un promotor σ54. Por similitud de secuencia proponemos que el gen hpxA codifica una racemasa que permitiría la formación de (S)‐alantoina. El producto del gen hpxB es una alantoinasa que cataliza la degradación de alantoina a alantoato, esta enzima presenta homología con la nueva alantoinasa (PuuE) independiente de metales identificada en “Pseudomonas fluorescens”. En base a similitud de secuencia proponemos que el gen hpxC codifica una alantoina permeasa que permitiría la entrada a la célula de la alantoina presente en el medio extracelular. El gen guaD codifica una guanina desaminasa que cataliza el paso de guanina a xantina. El gen hpxS codifica una proteína de la familia de reguladores GntR que podría tener un papel dual, actuando como represor en ausencia de alantoina y como activador cuando este metabolito está presente en el medio. HpxS se une a dos sitios contiguos, S1 y S2, cubriendo las cajas ‐ 10 y ‐35 del promotor del operón hpxSAB. La caracterización de la regulación del sistema se ha llevado a cabo mediante diversas metodologías, analizando diferentes cepas mutantes y distintas condiciones de disponibilidad de nitrógeno. Los resultados obtenidos muestran que el cluster hpxSAB-hpxC-guaD está sometido a una doble regulación, la llevada a cabo por el sistema global del nitrógeno y la regulación específica de la vía. La unidad transcripcional hpxSAB es la más regulada, su expresión se induce cuando la alantoina es la fuente de nitrógeno a diferencia de las otras dos unidades transcripcionales hpxC y guaD cuya expresión no es inducida por este metabolito. La transcripción del gen guaD está regulada por la disponibilidad de nitrógeno por acción de la proteína NtrC. La expresión del gen hpxC parece ser constitutiva. Para que la inducción del operón hpxSAB sea completa es necesaria la presencia de las proteínas HpxS y NAC, las cuales podrían interactuar en presencia de alantoina. En lo que concierne al sistema hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ, se identificaron tres unidades transcripcionales de las cuales hpxFGHIJK y hpxWXYZ se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad σ70 de la RNA polimerasa mientras que en el promotor de hpxU se han identificado secuencias de unión tanto para σ(54) como para σ(70). Por similitud de secuencia se propone que los genes hpxFGHI codifican un sistema de transporte tipo ABC que permitiría la entrada del alantoato a la célula. Los genes hpxJ y hpxK codifican una ureidoglicina aminotransferasa y una alantoato amidohidrolasa respectivamente. La proteína HpxK hidroliza el alantoato para producir ureidoglicina, posteriormente HpxJ cataliza la transaminación entre la ureidoglicina y un α‐cetoácido para producir oxalurato y el correspondiente aminoácido. Por similitud de secuencia se propone que las proteínas codificadas por los genes hpxW y hpxY podrían ser una oxamato y una oxalurato amidohidrolasa respectivamente. HpxZ podría estar implicada en la utilización de oxalurato. El gen hpxU codifica una proteína reguladora perteneciente a la familia RpiR que en ausencia de alantoato, reprime la expresión del operón hpxFGHIJK además de regular su propia transcripción. La regulación del cluster hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ se realiza por el sistema global de nitrógeno y por el regulador específico. El alantoato induce la expresión de los genes hpxU y hpxFGHIJK. La transcripción del gen hpxU está levemente regulada por la disponibilidad de nitrógeno.; This study is focused in allantoin and allantoate metabolism as nitrogen source in Klebsiella pneumoniae. Genes implicated in this metabolism are grouped in two different clusters: hpxSAB-hpxC-guaD and hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ. The first one transforms allantoin into allantoate, while the second one is responsible for allantoate degradation. hpxSAB-hpxC-guaD system includes an allantoin racemase, an allantoinase, an allantoin permease, a guanine deaminase and a transcriptional regulator that belongs to the GntR family. The transcriptional regulation of this cluster is carried out by the NTR system and the specific regulator HpxS. The mainly regulated transcriptional unit is hpxSAB, wich needs the presence of NAC, HpxS and allantoin for full induction. The expression of hpxC is constitutive, while guaD is regulated by the protein NtrC. On the other hand, hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ system includes an ureidoglycine aminotransferase, an allantoate aminohydrolase and a transcriptional regulator that belongs to the RpiR family. An analysis by sequence comparison suggests that in this cluster there might be as well an ABC-type transport system, an oxalurate aminohydrolase and an oxamate aminohydrolase. The transcriptional regulation of this cluster is carried out by the NTR system and the specific regulator HpxU. In the absence of allantoate, the protein HpxU represses transcription of hpxU y hpxFGHIJK. Tue, 13 Nov 2012 09:28:01 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/94194 2012-11-13T09:28:01Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84091 Control hormonal i genètic de la síndrome de fugida de l’ombra en "Arabidopsis thaliana" Salla i Martret, Mercè Les plantes disposen d’una sèrie de fotoreceptors que informen de manera contínua sobre les característiques lumíniques ambientals, permetent optimitzar el seu creixement i desenvolupament. Els fitocroms són els fotoreceptors millor caracteritzats, que absorbeixen en la regió del roig (R) i del roig llunyà (FR). De tots els processos que regulen, la síndrome de fugida de l’ombra o SAS (de l’anglès shade avoidance syndrome) és probablement el més important en plantes crescudes en llum. La SAS es refereix al conjunt de respostes induïdes en plantes creixent en alta densitat o sota una coberta vegetal. Malgrat la complexitat d’aquestes respostes, la SAS s’indueix per un sol senyal ambiental, que és la disminució de la raó R:FR, la percepció de la qual pels fitocroms inicia una xarxa transcripcional. En el nostre laboratori ens hem centrat en un grup de gens l’expressió dels quals està ràpida i directament alterada per llum de baixa raó R:FR o ombra simulada, anomenant-los gens PAR (de l’anglès phytochrome rapidly regulated). En la present tesi s’ha aprofundit en l’estudi de la cadena de transducció de la senyal en la SAS en Arabidopsis thaliana, emfatitzant en els punts de connexió amb les rutes transcripcionals hormonals. Resultats d’aquesta tesi, que es complementen amb d’altres obtinguts anteriorment en el grup, demostren que un dels gens PAR, ATHB4, que codifica per un factor de transcripció del tipus Homeo-Domain Leucine-Zipper (HD-ZIP subfamília II), té un paper en la senyalització de la SAS com a un modulador complex en aquestes respostes, involucrant diferents hormones en la seva acció. Per dur-ho a terme es van fer aproximacions amb mutants de guany de funció (de sobreexpressió constitutiva amb activitat induïble) i de pèrdua de funció. Particularment s’ha caracteritzat fisiològica, molecular i histològicament el doble mutant athb4hat3, resultats que mostren una disminució de la resposta a diferents estímuls (hormonals i de llum) d’aquest doble mutant. També hem investigat el paper d’ATHB4 com a regulador del desenvolupament vegetal coactuant amb HAT3 a través d’estudis histològics i moleculars del doble mutant ahb4hat3, el qual mostra fortes alteracions morfològiques relacionades amb la polaritat en el desenvolupament. Per aprofundir, hem investigat el paper dels quatre membres més propers (pertanyents a HD-Zip II) en les respostes SAS i al control hormonal a nivell molecular i/o fisiològic utilitzant línies de sobreexpressió i de pèrdua de funció, englobant els resultats en un possible mòdul regulador de determinades respostes de la planta. Aquesta hipòtesi ve recolzada pels resultats que els identifiquen com a gens reguladors complexos d’aquesta resposta. En paral•lel, hem estudiat l’expressió de SAUR15, un gen de resposta a auxines, BRs i ombra simulada; el qual està regulada per ATHB4 de manera directa. S’han identificat elements E-box i AREs, i s’ha estudiat el seu paper en les respostes a ombra i a hormones. Els nostres resultats mostren que aquests elements no són imprescindibles per a la correcta resposta del promotor als estímuls aplicats. Una altra aproximació fou l’estudi de la resposta SAS de mutants específics de brassinosteroides i auxines (els quals estan relacionats amb la modulació de l’expressió de SAUR15), on resultats de la tesi suggereixen una connexió entre BRs i la resposta a ombra simulada. Els resultats obtinguts en quant a components moleculars involucrats en les respostes SAS provenen de l’anàlisi de tota la plàntula sencera. Donat que els llocs de percepció de la llum i de l’acció poden estar físicament separats a la planta, vam estudiar la importància de la comunicació a llarga distància per entendre com la planta creix i es desenvolupa regulada per la llum durant la SAS, obtenint com a resultat que tant els cotilèdons com el meristem apical són importants, però no imprescindibles, en aquesta resposta.; "Hormonal and genetic control of shade avoidance syndrome in Arabidopsis thaliana " Plants sense the presence of competing neighboring vegetation as a change in light quality: i.e. they sense the reduced ratio of red light to far-red light. The responses to shade are generally referred to as the shade avoidance syndrome (SAS), and involve various developmental changes intended to outgrow or outcompete the neighboring plants. In this thesis we analyzed the function of ATHB4, a gene encoding a homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) class-II transcription factor from Arabidopsis thaliana, the expression of which is rapidly and directly upregulated after proximity perception by the phytochrome photoreceptors. Our results, altogether with previous studies in my group, suggest that some members of this small gene subfamily can modulate SAS responses by controlling auxin, brassinosteroid and gibberellin molecular and/or physiological responsiveness. In particular, we propose ATHB4 as a new shade signaling component that participates in integrating shade perception and hormone-mediated growth. To get this conclusion we perform experiments with overexpression and loss-of-function lines. We specially characterized double mutant athb4hat3, which has strong morphological alterations, and which let us find a connection point between light and development concerning polarity. Fri, 14 Sep 2012 07:00:42 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84091 2012-09-14T07:00:42Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84073 The structure and function of maize scutellum during early stages of germination Tnani, Hédia The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains. The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains. The embryonic axis originates the root, leaves and stem of the new plant. In the mature seed, the embryo axis is formed by the primary root, protected by the coleorhiza, and the stem tip with five or six short internodes and leaf primordia which, as a whole, form the plumule that is surrounded by the coleoptile. The name scutellum (small shield, in latin) derives from its shield-like shape and it liesbetween the embryonic axis and endosperm. Dissected scutellum constitutes 11% or the kernel mass, and about 90% of the embryo. During germination, scutellar epithelial cells suffer an elongation that increases the contact surface between the endosperm and the scutellum and facilitates the transport of the nutrients from the endosperm to the embryo. Scutellar cell elongation is inhibited by ABA and salicylic acid, basic and acid pH and high concentrations of sorbitol. Exogenous gibberellins stimulate elongation, but a reduction in gibberellin synthesis or perception does not inhibit it. Elongation is inhibited by sucrose, but not glucose. Transcription and translation inhibitors reduce scutellar cell elongation, indicating that transcription and translation are necessary for the elongation process. Scutellar epithelium cells play specific roles during germination different to parenchymal cells. So, we expect some differences in the gene expression pattern of this tissue. That’s why we construct a cDNA library using RNA extracted from scutellar epithelial cells 1 day after imbibition and selected them using array hybridization comparing the mRNA accumulated in epithelial cells with the mRNA accumulated in the other scutellar tissues. We identified 30 genes up-regulated in the epithelium. A high proportion of these genes are involved in metabolic processes, the production of energy or in the transport of peptides into the embryo. The roles of 43% of these genes remains undetermined, 27% of them are involved in metabolic processes, 13% in protein synthesis or processing and 7% in cell structure. One of the identified genes from the macroarrays is a peptide transporter: ZmPTR1. It encodes a non-characterized maize peptide transporter protein which has 587 amino acids with a calculated molecular mass of 64.52 kDa. This maize transporter is predominantly expressed in the scutellar epithelium during germination. ZmPTR1 is also expressed to a less extent in the radicle and the hypocotyl. ZmPTR1 is located in the tonoplast and has high sequence similarity with tonoplast di- and tripeptide transporters AtPTR2, AtPTR4 and AtPTR6 from Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 is able to transport at least Ala-Ala dipeptide across the membrane and could have a role in the intracellular transport of di- and tripeptides. Seed germination is a complex process that requires cell division, expansion and differentiation. It involves the activation of many metabolic pathways and signal transduction processes, which require a great quantity of energy and stored materials which are provided by seed reserves (oil, storage proteins and starch) and the synthesis and/or activation of many proteins. Plant seeds store triacylglycerols (TAGs) into oil bodies (OBs), specialized organelles which serve as an energy reserve during germination and post-germinative growth. Protein composition analysis of oil bodies from maize embryos during germination identified, in addition to the previously characterized OB-associated proteins, other proteins of diverse function: an embryonic protein DC-8, a globulin 2, 4 proteins with enzymatic activity (protein disulfide isomerase, xylose isomerase, strictosidine synthase and precursor and ATP synthase beta chain), a protein similar to karyopherin- beta-3 (Kap) and a stress induced membrane pore protein involved in membrane transport. Quantitative subproteomic analysis of germinating related changes in the oil bodies of maize scutellum between dry seeds and 2 dai seeds allowed the identification of new proteins interacting with oil bodies in dry seeds or in germinating seeds. In dry seeds: oleosins, cupins, disulfide isomerases, a nucleoside phosphate kinase, a class IV heat shock protein, an embryonic protein DC-8, a 60S acidic ribosomal protein P0 and a rubber elongation factor protein. In germinating seeds: oleosins, mitochondrial protein Tim17, prohibitin-2 and a manganese superoxide dismutase (Mn-SOD).; ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL ESCUTELO DE MAÍZ DURANTE LAS PRIMERAS ETAPAS DE LA GERMINACIÓN Durante la germinación, las células epiteliales del escutelo sufren una elongación que aumenta la superficie de contacto entre el endospermo y el embrión y facilita el transporte de los nutrientes del endospermo al embrión. La elongación de las células del escutelo es inhibida por ABA y ácido salicílico, pH básico y ácido y altas concentraciones de sorbitol. Las giberelinas exógenas estimulan la elongación, pero una reducción en la síntesis de giberelinas o percepción no la inhiben. La elongación es inhibida por la sacarosa, pero no la glucosa. Los inhibidores de la transcripción y traducción reducen el alargamiento de las células escutelares, lo que indica que la transcripción y la traducción son necesarias para el proceso de alargamiento. Se identificaron 30 genes que muestran una expresión diferencial significativa en las células epiteliales del escutelo de un día después de la imbibición. Las funciones de un 43% de estos genes no se conoce, el 27% de ellos están involucrados en los procesos metabólicos, el 13% en la síntesis o la transformación de proteínas y el 7% en la estructura celular. ZmPTR1 codifica un transportador de maíz péptido no ha sido previamente caracterizado, se expresa predominantemente en el epitelio escutelar durante la germinación. ZmPTR1 se expresa también en menor medida en la radícula y del hipocotilo. La proteína ZmPTR1 se localiza en el tonoplasto y es homóloga a las otras proteínas transportadoras de di-y tripéptidos AtPTR2, AtPTR4 y AtPTR6 de Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 es capaz de transportar al menos el dipéptido Ala-Ala. El análisis proteómico de las proteínas asociadas a los cuerpos lipídicos en escutelo de maíz durante la germinación ha permitido la identificación de, además de proteínas previamente caracterizadas asociadas OB, otras proteínas de funciones diversas. El Análisis cuantitativo subproteómico de los cambios relacionados con los cuerpos lipídicos en el escutelo de maíz entre semillas secas y semillas 2 dias después de la germinación permitieron la identificación de nuevas proteínas que interactúan con los cuerpos lipídicos en las semillas secas o en la germinación de las semillas. Wed, 12 Sep 2012 10:52:42 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84073 2012-09-12T10:52:42Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84059 Resistance to HIV entry inhibitors: signature mutations as tool guide for the identification of new antiviral agents González-Ortega, Emmanuel There are several reasons to celebrate the latest advances in the treatment of the infection with HIV. According to the Joint United Nations Programme on HIV/AIDS, the number of new infections dropped by 15%; there is also a decrease by 22% in the number of deaths related to HIV/AIDS. Nevertheless, there are new emerging challenges, i.e. the transmission of drug-resistant HIV-1 strains. Therefore, there is a demand for the continued research for new and more potent antiretroviral agents. The entry of HIV into the cell implies a complex and well-orchestrated series of steps in which both viral and cellular molecules are implied, ending with the production of new viral particles. The HIV gp120 glycoprotein binds to the cellular CD4 receptor and to a chemokine receptor, inducing structural rearrangements that continue with the cellular and viral membrane fusion mediated by the HIV glycoprotein gp41. Hence, the entry of HIV is an essential step of the viral replication that offers an open path for the design of new antiviral compounds that could be added to the repertory of drugs used in the treatment of HIV infection. In coincidence with the recent and highly relevant information of the fusion mechanism occurring during the viral entry, the design of new fusion inhibitors has become one of the most promising and debated areas in the study of entry inhibitors. ADS-J1 was originally selected to bind to gp41 and to inhibit the fusion of membranes. In several assays, including the generation of HIV strains resistant to ADS-J1, our laboratory has proved that ADS-J1 interact with gp120 instead of gp41. A more recent publication suggested that ADS-J1 binds to the pocket region of gp41 preventing the infection by the virus. Here, we confirmed that ADS-J1 interacts with gp120 instead of gp41. Recombination of gp120 into a wild type HIV-1 backbone restored the resistant phenotype. Moreover, time of addition assays clearly demonstrated that ADS-J1 does not interact with gp41. VIRIP was identified as a natural peptide present in human hemofiltrate that inhibits the HIV gp41-mediated membrane fusion. It was suggested that VIRIP interact with the fusion peptide in gp41, therefore blocking the fusion of membranes. With the objective to determine the precise mode of action of VIRIP, we generated a HIV-1 virus resistant to VIR-353, an analogue of VIRIP. Additionally, we determined the most relevant combination of mutations for the resistant phenotype. Recent studies have shown the effectivity of VIR-576, a peptide closely related to VIRIP and VIR-353 in a clinical trial phase I/II. The resistance to VIRIP/VIR-353 took a long time to emerge, suggesting a high genetic barrier to resistance. The mutations responsible for the resistant phenotype affected in large scale the replicative capacity of the virus, nevertheless, several compensatory mutations restored the viral fitness, while the resistance to VIR-353 was unaltered. The antiviral combination of VIR-353 and T20 showed an additive effect in inhibiting viral replication, indicating that VIR-353 appeared no to affect the binding of T20 to gp41 in its antiviral activity, the combination of the two fusion inhibitors showed an additive effect in inhibiting viral replication. In general, our results evidence the plasticity of the HIV envelope glycoproteins. This plasticity is highly remarked when the virus replicates under drug selective pressure, which imposes an additional genetic barrier for the virus to overcome.; ADS‐J1 ha estat seleccionat per unir‐se a gp41 i inhibir la fusió de les membranes. A través de diversos assajos, incloent la generació de soques resistents a ADS‐J1, el nostre laboratori va demostrar que ADS‐J1 interactua amb gp120 i no amb gp41. Una publicació posterior va suggerir que ADS‐J1 s’uneix a la ‘pocket‐region’ de gp41, prevenint l’infecció pel virus. En el present treball, nosaltres confirmem que ADSJ1 interactua amb gp120 i no amb gp41 i que la recombinació de gp120 en un VIH silvestre restitueix el fenotip resistent. Assajos de temps de addició van demostrar clarament que ADS‐J1 no interactua amb gp41. VIRIP va ser identificat com un pèptid natural present en el hemofiltrat humà capaç d’inhibir la fusió de membranes operada per gp41 del VIH. Es va suggerir que VIRIP interactua amb el pèptid de fusió de gp41, bloquejant la fusió de les membranes. Nosaltres hem generat un virus resistent a VIR‐353, un anàleg de VIRIP. Addicionalment, hem determinat la combinació de mutacions que generen el fenotip resistent. Estudis recents van mostrar l'efectivitat de VIR‐576, un pèptid amb alta similitud a VIRIP i VIR‐353 en un assaig clínic fase I/II. La resistència a VIRIP/VIR‐353 va requerir un període de temps llarg per emergir, la qual cosa suggereix una elevada barrera genètica a la resistència. Les mutacions responsables del fenotip resistent van afectar en greument la capacitat replicativa del virus, no obstant això, diverses mutacions compensatòries van restaurar‐ne la capacitat replicativa, mantenint intacta la resistència a VIR‐353. L’activitat antiviral de T20 no sembla afectada per VIR‐353, la combinació dels dos inhibidors de fusió van mostrar un efecte additiu en la inhibició de la replicació. En general, els nostres resultats evidencien la plasticitat de les glicoproteïnes de l'embolcall del VIH. Aquesta plasticitat es realça quan el virus replica sota la pressió selectiva imposada per fàrmacs que inhibeixen la replicació viral, la qual cosa afegeix una barrera genètica addicional a ser superada pel virus. Fri, 07 Sep 2012 11:48:51 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/84059 2012-09-07T11:48:51Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83864 Relació estructura-funció de les proteïnes CPT1 Pujol Vidal, Maria Magdalena L’enzim Carnitina palmitoïltransferasa 1 (CPT1) permet l’entrada dels àcids grassos de cadena llarga a la matriu mitocondrial per tal de ser degradats i utilitzats així com a substrat energètic. El malonil-CoA, primer intermediari en la síntesi d’àcids grassos, és un inhibidor al•lostèric de CPT1, fet que permet una regulació coordinada entre la síntesi i l’oxidació d’àcids grassos en un mateix teixit, evitant així que es donin ambdós processos alhora. Una inhibició específica de CPT1, doncs, és una bona aproximació farmacològica per al tractament de desordres metabòlics que impliquin acumulació d’àcids grassos i resistència a insulina, com la diabetis tipus 2 i l’obesitat. La present tesi doctoral s’ha centrat en l’estudi de la regulació per malonil-CoA dels isotips hepàtic (CPT1A) i muscular (CPT1B) de CPT1, així com en l’estudi de l’isotip més recentment descrit de la proteïna d’expressió en cervell, CPT1C. Per tal d’aprofundir en l’estudi de determinants moleculars de CPT1 que marquen el seu grau d’inhibició per malonil-CoA, s’han realitzat construccions mutants i delecionades dels enzims CPT1A i CPT1B i s’han expressat en el llevat “Pichia pastoris”. Mitjançant l’anàlisi del paràmetre IC50, hem demostrat que la regió aminoterminal de l’enzim CPT1A de rata (residus 1-18) exerceix un efecte dominant sobre les posicions Glu590 i Met593 en determinar la sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA. Paral•lament, s’han generat construccions amb la seqüència de l’enzim CPT1 de porc, que presenta una gran diferència en el seu comportament enzimàtic quan es compara amb l’enzim humà, tant l’isotip hepàtic com el muscular. En aquest treball s’ha identificat l’existència d’un determinant negatiu en la posició Glu17 que explica parcialment la menor sensibilitat d’aquest enzim a la inhibició pel malonil-CoA. A més a més, s’ha construït un model 3-D in silico de la CPT1B humana, que permet justificar observacions experimentals mostrades en aquest treball, tot i que no explica encara les diferències en el comportament cinètic entre els isotips hepàtics i musculars de la proteïna. CPT1C és l’isotip descrit més recentment, i encara avui se’n desconeix la seva funció, existeix controvèrsia respecte a la seva distribució subcel•lular i no se n’han descrit els mecanismes que en regulen l’expressió. Els resultats mostrats en aquest treball demostren que CPT1C és una proteïna sense activitat enzimàtica, independentment de la característica extensió C-terminal que presenta respecte els altres isotips. D’altra banda, el patró d’expressió observat del gen Cpt1c no és compatible amb el paper que se li ha atorgat sobre la regulació de la ingesta. A més a més, hem identificat l’expressió d’una isoforma soluble de CPT1C en cervell humà adult, que ofereix una eina útil per a l’obtenció d’un cristall de la regió C-terminal citosòlica de CPT1C.; STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP OF CPT1 PROTEINS CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1) enables the entry of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix, in order to be degraded and used as energetic substrate. Malonyl-CoA, the first intermediate in the synthesis of fatty acids, is an allosteric inhibitor of CPT1. Through CPT1 inhibition, it establishes a coordinated regulation between fatty acid synthesis and oxidation, thus preventing that both pathways coexist at the same time. A specific inhibition of CPT1 is therefore a good approximation or the pharmacological treatment of metabolic disorders involving accumulation of fatty acids and nsulin resistance, such as type-2 diabetes and obesity. This thesis has focused on the study of malonyl-CoA regulation of both CPT1A and CPT1B isotypes. In addition, we studied the more recently described isotype of the protein, CPT1C. To gain insight into the study of CPT1 molecular determinants of malonyl-CoA inhibition, mutants of both CPT1A and CPT1B enzymes were expressed in yeast Pichia pastoris. Analysis of the IC50 parameter, demonstrated that the aminoterminal region (residues 1-18) of the rat CPT1A enzyme has a dominant effect over Glu590 and Met593 positions in determining its sensitivity to malonyl-CoA inhibition. We also identified the existence of a negative determinant within the sequence of pig CPT1A (position Glu17), which partially explains the low sensitivity of this enzyme to malonyl-CoA inhibition. In addition, we designed an in silico 3-D model of human CPT1B, which still does not explain the kinetic differences between liver and muscle isotypes of the protein, but justifies some of our experimental data. CPT1C is the more recently described isotype of the protein. Its function still remains unknown, and controversy exists regarding its subcellular distribution and the mechanisms that regulate its expression. Here we show that CPT1C is a protein without enzymatic activity, regardless of its characteristic C-terminal extension, compared to the other isotypes. Moreover, the observed gene expression pattern is not compatible with its given role on the regulation of food intake. In addition, we identified the expression of a soluble isoform of CPT1C in human adult brain, providing a useful tool for obtaining a crystalline structure of the cytosolic C-terminal region of CPT1. Fri, 27 Jul 2012 09:04:22 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83864 2012-07-27T09:04:22Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83820 Abiotic stress in plants: Late Embryogenesis Abundant proteins Amara, Imen In order to improve our understanding on LEA proteins and their molecular functions in drought tolerance, the present work analyzes in the first place, the composition of LEA subproteomes from Arabidopsis seeds and maize embryos; second, three maize embryo LEA proteins from groups 1, 2, and 3 are analyzed in order to detect functional differences among them and finally, transgenic maize plants over-expressing group 5 “rab28” lea gene are characterized. The following results are presented: - Chapter 1. Proteomic approach to analyze the composition of LEA subproteomes from Arabidopsis seeds by mass spectrometry. The main objective was the development and isolation method to obtain enriched LEA populations from Arabidopsis seeds. LEA subproteomes were obtained using an extraction procedure that combines heat stability and acid solubility of LEA proteins. To identify the protein content, we followed two approaches: first, a classical 1D (SDSPAGE) gel-based procedure associated with MS analysis using an electrospray ionization source coupled on-line to liquid chromatography (LC-ESI-MSMS) and second, a gel-free protocol associated with an off-line HPLC and analysis via matrix assisted laser desorption/ionization (LC-MALDI-MSMS). - Chapter 2. Proteomic analysis of LEA proteins accumulated in maize mature seeds. Identification of LEA protein content by mass spectrometry and selection of three LEA proteins, Emb564, Rab17 and Mlg3, as representatives of groups 1, 2 and 3 for further study. Comparative functional analysis covering different aspects of maize Emb564, Rab17 and Mlg3 proteins, posttranslational modifications, subcellular localization and their properties in in-vitro and in- vivo assays. - Chapter 3. Characterization of transgenic maize plants expressing maize group 5 rab28 LEA gene under the ubiquitin promoter. Evaluation of Rab28 transcripts and protein levels, phenotype and stress tolerance traits of transgenic plants under drought stress. Investigation of the subcellular localization of transgenic and wild-type Rab28 protein using immunocytochemical approaches.; Las proteínas LEA, originalmente fueron descritas en las semillas de algodón; se acumulan en grandes cantidades en estructuras tolerantes a la desecación (semillas, polen) y en tejidos vegetativos sometidos a estrés abiótico, sequía, salinidad y frío. También se hallan en organismos anidrobióticos, en plantas de resurrección, algunos invertebrados y microorganismos. La presencia de proteínas LEA se correlaciona con la adquisición de tolerancia a la desecación. Desde un principio se les atribuyó un papel en las respuestas de las plantas en la adaptación al estrés (revisado en Bartels and Salamini 2001, Tunnacliffe 2007, Shih et al. 2010, Tunnacliffe 2010, Hand et al. 2011). Las proteínas LEA se clasifican en diversos grupos en función de dominios y secuencias de aminoácidos específicos (Wise 2010, Batagglia et al 2008, Bies-Ethève et al 2008). Los grupos 1, 2 y 3 son los más relevantes ya que abarcan la mayoría de las proteínas de la familia LEA. Una característica general de estas proteínas es su elevada hidrofilicidad, alto contenido de aminoácidos cargados y su falta de estructura en estado hidratado. A pesar de encontrarse mayoritariamente en forma de “random coil”, algunas adquieren un cierto grado de estructura durante la deshidratación o en la presencia de agentes promotores de α-hélices (Shih et al. 2010, Hand et al. 2011). A nivel celular se han hallado en todas las localizaciones, citosol, núcleo, nucleolo, mitocondria, cloroplasto, vacuola, retículo endoplásmico, peroxisoma y membrana plasmática, donde se supone ejercen su función protectora frente al estrés (Tunnacliffe and Wise 2007, Hundertmark and Hincha 2008). En relación a las modificaciones post-traduccionales, algunas se hallan fosforiladas (Jiang and Wang 2004; Plana et al. 1991, Heyen et al. 2002, Rohrig et al. 2006). Los efectos protectores de las varias proteínas LEA se han demostrado mediante ensayos in vitro y en aproximaciones transgénicas que han dado lugar a fenotipos resistentes a la sequía, sal y frío. Por lo general, se considera que estas proteínas contribuyen a la protección y a la estabilización de macromoléculas y estructuras celulares en las respuestas de adaptación al estrés en plantas; sin embargo, sus funciones específicas aún no han sido esclarecidas. A nivel molecular se ha propuesto que las funciones de las proteínas LEA pueden ser variadas: estabilización y renaturalización de proteínas, mantenimiento de membranas, en combinación, o no, con azúcares, tampones de hidratación (substitución de moléculas de agua), afinidad por iones y función antioxidante (Tunnacliffe and Wise 2007, Shih et al. 2010, Batagglia et al. 2008). Para finalizar, diremos que los objetivos principales de esta tesis consisten en ampliar los conocimientos sobre las proteínas LEA y sus funciones relativas a la tolerancia a la sequía. Los resultados están presentados en forma de capítulos. Wed, 25 Jul 2012 10:35:45 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83820 2012-07-25T10:35:45Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83535 Perfiles de expresión de tumores de distinto origen genético de "Drosophila melanogaster" Mendizabal Oyarzabal, Leire El término “cáncer” agrupa un amplio grupo de enfermedades que implican proliferación celular descontrolada y que afectan a casi cualquier tejido del organismo. Es la principal causa de mortalidad a nivel mundial; 7,6 millones de personas fallecieron por cáncer en 2008 y se prevé que la cifra de defunciones alcanzará los 11 millones en 2030. El denominador común de todas estas muertes es la malignidad tumoral, definida como la capacidad para invadir tejidos sanos y formar metástasis, que aparecen incluso años después del tratamiento del tumor primario. La mayor limitación en la búsqueda de soluciones terapéuticas efectivas contra el cáncer es la heterogeneidad de los tumores. Estos se componen de distintos tipos celulares que varían en su morfología, índice de proliferación, grado de diferenciación, anomalías genéticas, capacidad metastásica y resistencia a tratamientos, hasta tal punto que un tumor llega a desarrollar características específicas en cada paciente. Conocer cuáles son los mecanismos responsables de esta heterogeneidad es un objetivo clave en el estudio de la biología del cáncer, ya que permitiría abordar la génesis de la enfermedad y desarrollar terapias dirigidas a la/s célula/s que originan el tumor. Este abordaje requiere de modelos experimentales en los que se pueda inducir la formación de un tumor desde un origen conocido, seguir su evolución en comparación con el desarrollo normal del tejido control y analizar las alteraciones que desencadenan la transformación maligna. Estudios pioneros en Drosophila identificaron el primer ejemplo de ¿gen supresor de tumores¿. Sucesivos trabajos en este sistema modelo han permitido conocer un número considerable de genes implicados en oncogénesis, muchos de los cuales son reguladores esenciales de la división de las células madre. El desarrollo de protocolos para la inducción y el crecimiento de estos tumores ha permitido recapitular en Drosophila, a partir de mutaciones génicas únicas, la formación e inmortalización de tumores malignos que comparten muchas de las características esenciales del cáncer en humanos. Sin embargo, aún queda un largo camino hasta identificar qué alteraciones son responsables de la transformación maligna. En este contexto, las técnicas de transcriptómica proporcionan una herramienta clave para analizar los perfiles de expresión génica característicos de tumores en distinto estadio de desarrollo y/o de distinto origen, y su aplicación en tumores de Drosophila es el objetivo de este trabajo. Tue, 10 Jul 2012 09:24:28 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83535 2012-07-10T09:24:28Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83459 Metabolic signaling under nutrient deprivation De Sousa Coelho, Ana Luisa 1- ROLE OF SIRT1 IN THE REGULATION OF FATTY ACID OXIDATION AND KETOGENESIS UNDER DIFFERENT NUTRIONAL CHANGES. The homolog of the yeast silencing information regulator2 (SIRT1) has been implicated in several aspects of food limitation and caloric restriction in mammals. We have observed that there were no important changes, between wild type (WT) and SIRT1 liver-specific knockout (LKO) mice subjected to either CR or high fat diet (HFD), in the mRNA expression of Cpt1a, Cpt2 and Hmgcs2. SIRT1 had been shown to control hepatic glyconeogenic/glycolytic pathways in response to nutrients (Rodgers et al., 2005). So, we have hypothesized that SIRT1 could have a role in the metabolic adaptation to the changes of nutrient of weaning, when milk is replaced by the adult diet which contains less fat and more carbohydrate. Neither fatty acid oxidation (Cpt1a), ketogenesis (Hmgcs2), nor gluconeogenic (Pck1) liver pathways were significantly affected by the liver-specific knockdown of SIRT1, in both suckling and post-weaning conditions. If SIRT1 is involved in the response to aging, old LKO mice might be more susceptible to age-associated diseases as obesity, type 2 diabetes, hypertension, etc. To test this hypothesis we first weight and performed a glucose tolerance test in 7 months-old mice. There were no differences in weight neither in glucose tolerance between WT and LKO mice. Using a cell system, PPARα induced the expression of its known target genes CPT1A, HMGCS2, and FGF21 in HepG2 cells. SIRT1 overexpression by itself had almost no effect, although it increased PPARα induction of its target genes. We have interfered SIRT1 in these cells, and PPARα-induced expression of PEPCK and FGF21 was SIRT1-dependent. We have fasted WT and LKO mice for 15h and we found that the expression of Pck1 in liver was moderately but significantly induced in SIRT1-LKO mice after fasting, consistent with an increase in glucose levels. However, neither G6pase nor Pgc1α mRNA levels were affected. As expected, liver mRNA levels of Cpt1a, Hmgcs2, and Fgf21 were also induced upon fasting. However, Cpt1a and Hmgcs2 mRNA transcripts were comparable in fasted WT versus LKO mice, while Fgf21 expression was reduced around 40% in LKO mice liver. This result was consistent with the fact that fasting induction of FGF21 serum levels was also impaired in LKO mice. 2- ROLE OF SIRT1 IN THE HMGCS2 REGULATION OF FGF21 EXPRESSION. (Article 1: Human HMGCS2 regulates fatty acid oxidation and FGF21 expression in HepG2 cells. Vilà-Brau et al., 2011) Recently, our group has seen that HMGCS2 expression stimulates FGF21 expression and that these events are dependent on HMGCS2 activity. A catalytic dead mutant (C166A) failed to induce either fatty acid β-oxidation or FGF21 expression, whereas acetoacetate (an oxidized form of ketone bodies) could stimulate FGF21 mRNA expression in a dose-dependent manner. Because ketone bodies production implies the reduction of acetoacetate to β- hydroxybutyrate with the concomitant generation of NAD+ (Hegardt et al, 1999), and SIRT1 is a NAD+-dependent deacetylase enzyme, this specificity could explain why FGF21 fasting induction was affected in LKO-SIRT1 mice liver, while other PPARα target genes were not. We have treated HepG2 cells with the oxidizing (acetoacetate) partner of ketone bodies, and endogenous SIRT1 was knockdown by a specific siRNA. FGF21 induction was dependent on SIRT1 expression, since knocking down impaired acetoacetate response. 3- ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR 4-DEPENDENT INDUCTION OF FGF21 DURING AMINO ACID DEPRIVTION (Article 2: De Sousa-Coelho et al., 2012) Considering the central role of PPARα in the regulation of metabolic homeostasis we sought to investigate how the turnover of PPARα affected the expression of its target genes. HepG2 cells were infected with PPARα and exposed to DMSO or to the 26S proteasome inhibitor MG132. As expected, MG132-treatment blocked the PPARα-dependent expression of HMGCS2, indicating that the transcriptional activity of PPARα is increased by protein degradation (Blanquart et al, 2004). Contrary to what we had predicted, the expression of FGF21 was strongly increased by the MG132 treatment. We hypothesized that proteasome inhibition in HepG2 could decrease the pool of free amino acids. We treated HepG2 cells with histidinol (HisOH) a potent and reversible inhibitor of protein synthesis, (Hansen et al, 1972). Amino acid deprivation produced a time-dependent induction of FGF21 mRNA. To test whether this induction was due to an increase in the FGF21 gene transcription, we measured the FGF21 primary transcript (hnRNA) levels; HisOH treatment clearly induced FGF21 hnRNA levels in a time-dependent manner. As expected, HisOH induced an increase in the ATF4 protein levels after 2h treatment. By analyzing the sequence of the 5’-flanking region of the human FGF21 gene, we found two putative ATF4 response elements (AARE) starting at positions -152 and -610 upstream of the transcription start site. HepG2 cells were transfected with pGL3b-hFGF21 promoter-luciferase constructs and an expression vector for human ATF4. The expression of ATF4 induced the WT reporter in a concentration dependent manner. This induction was totally obliterated either when the AARE1 was mutated or when both elements were deleted. Induction was diminished when AARE2 was mutated. To further analyze the functionality of this sequence we tested the binding of ATF4 by an EMSA, where ATF4 bound as a C/EBPβ heterodimer to both AARE sequence elements. We also confirmed the in vivo binding by ChIP experiments. The chromatin binding of ATF4 was greatly increased in both ATF4 responsive sequences in HisOH treated cells. To confirm if the induction of FGF21 produced by amino acid starvation was mediated by ATF4, we treated siCtl and siATF4 HepG2 cells with HisOH. FGF21 mRNA levels after HisOH treatment were significantly lower when ATF4 was depleted. To analyze the effect of amino acid deprivation on FGF21 expression in vivo, we fed mice with a leucine-deficient [(-)leu] diet or a control (Ctl, nutrionally complete) diet for 7 days. Fgf21 mRNA levels were greatly increased in liver from mice fed a (-)leu diet compared to control. The circulating FGF21 levels were also increased in the serum of leucine deprived animals, paralleling hepatic gene expression. 4- LEUCINE DEPRIVATION SIGNALING UNDER FASTING CONDITIONS. We were interested to know whether FGF21 induction by a (-)leu diet would affect, or be affected by, the adaptive fasting response. We have fed mice for 7 days within a Ctl or (-)leu diet. Weights and food intake were recorded daily. Then, mice were randomly separated in a total of 4 groups, where 2 groups (one from each diet) were fasted overnight. Leucine deprivation affected the levels of free fatty acids and ketone bodies in serum in the fed state, while it does not upon fasting. Although no changes between groups were observed in the fed state, after fasting the β-oxidation, ketogenesis and gluconeogenesis keygenes were further up-regulated in the (-)leu diet group compared to control. The highest induction was seen in the Pgc1α gene, a known coactivator on these processes. The fasting activation of FGF21 was impaired in mice fed with (-)leu diet, underlying a crosstalk between the fasting and amino acid deprivation signalling. 5- ROLE OF FGF21 IN THE LEUCINE DEPRIVATION PHENOTYPE IN MICE (Article 3: De Sousa-Coelho et al., in preparation). According with our previously reported results (De Sousa-Coelho et al., 2012) mice maintained on a leucine-deficient [(-)leu] diet show a dramatic increase in FGF21 circulating levels. To check its origin we analyzed the Fgf21 gene expression in liver, where Fgf21 mRNA levels paralleled those in serum; brown adipose tissue (BAT), where it were unchanged; and in epididymal white adipose tissue (eWAT), where unexpectedly it were significantly decreased in wild type mice maintained in (-)leu diet. Because upon (-)leu diet, mice undergo rapid weight loss (Cheng et al., 2010), we wanted to investigate whether this phenotype is FGF21-dependent. For this purpose, WT and FGF21-KO mice were fed a Ctl or (-)leu diet for 7 days. Weight loss was diminished in FGF21-KO, while food intake decrease by (-)leu was unchanged between genotypes. Histological analysis of WAT showed that leucine deprivation resulted in a reduction in adipocyte volume compared with mice fed a control diet, while it was only slightly reduced in (-)leu FGF21-KO mice. It has been previously described that leucine deprivation increases lipolysis in WAT (Cheng et al., 2010). Consistent with changes in body weight, lack of FGF21 significantly decreased levels of phosphorylated (P)-HSL in WAT, indicating an impaired lipolysis. Gene expression analysis revealed reduction in the mRNA levels of the lipogenic genes Fas, Srebp1c and Acc1 in the WAT of mice maintained in (-)leu diet. These changes were impaired in FGF21-KO. Consistent with previous results (Cheng et al., 2010), leucine deprivation increased levels of Ucp1 mRNA in WT mice BAT. This increase was not observed in the FGF21-KO mice. mRNA levels of Pgc1α, which regulates the expression of Ucp1 (Handschin and Spiegelman, 2006), were also increased, although did not differ between WT and FGF21-KO mice under either control or (-)leu diet conditions. It has been recently proposed a link between FGF21 and SREBP1c during lipogenesis in HepG2 cells (Zhang et al., 2011). We examined levels of Fas, Srebp1c and Acc1 mRNA in liver of WT and FGF21-KO. As expected (Guo and Cavener, 2007), lipogenic program was decreased upon (-)leu diet, but this reduction was blocked in FGF21-KO mice. However, the amino acid response program was correctly initiated in these mice as shown by the increased levels of ATF4 protein and the increase in mRNA levels of Asns, a prototypical ATF4 target gene. The liver staining showed a decreased lipid accumulation under (-)leu in WT animals that is not produced in the FGF21-KO mice. These results demonstrate an important role of FGF21 in the regulation of lipid metabolism during amino acid starvation. References: Blanquart C, Mansouri R, Fruchart JC, Staels B, & Glineur C (2004) Different ways to regulate the PPARalpha stability. Biochem Biophys Res Commun 319, 663-70. Cheng, Y., Meng, Q., Wang, C., Li, H., Huang, Z., Chen, S., Xiao, F., and Guo, F. (2010). Leucine deprivation decreases fat mass by stimulation of lipolysis in white adipose tissue and upregulation of uncoupling protein 1 (UCP1) in brown adipose tissue. Diabetes 59, 17-25. Guo, F., and Cavener, D.R. (2007). The GCN2 eIF2alpha kinase regulates fatty-acid homeostasis in the liver during deprivation of an essential amino acid. Cell Metab 5, 103-14. Handschin, C., and Spiegelman, B.M. (2006). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 coactivators, energy homeostasis, and metabolism. Endocr Rev 27, 728-735. Hansen BS, Vaughan MH, & Wang L (1972) Reversible inhibition by histidinol of protein synthesis in human cells at the activation of histidine. J Biol Chem 247, 3854-3857. Hegardt FG (1999) Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase: a control enzyme in ketogenesis. Biochem J. 338, 569-582. Hotta, Y., Nakamura, H., Konishi, M., Murata, Y., Takagi, H., Matsumura, S., Inoue, K., Fushiki, T., and Itoh, N. (2009). Fibroblast growth factor 21 regulates lipolysis in white adipose tissue but is not required for ketogenesis and triglyceride clearance in liver. Endocrinology 150, 4625-4633. Rodgers JT, Lerin C, Haas W, Gygi SP, Spiegelman BM, Puigserver P (2005) Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1. Nature 434, 113-8 Zhang, Y., Lei, T., Huang, J.F., Wang, S.B., Zhou, L.L., Yang, Z.Q., and Chen, X.D. (2011). The link between fibroblast growth factor 21 and sterol regulatory element binding protein 1c during lipogenesis in hepatocytes. Mol Cell Endocrinol 342, 41-47.; Durante su vida un individuo se somete a diversos cambios nutricionales. La capacidad de detectar la disponibilidad de nutrientes y regular la homeostasis energética es un proceso fundamental. SIRT1 es un regulador clave en el metabolismo energético. SIRT1 puede modular la expresión génica en tejidos metabólicamente activos en respuesta a la restricción calórica o el ayuno. La dependencia de la actividad deacetilasa de SIRT1 en los niveles de NAD+ constituye un vínculo fundamental entre el estado metabólico celular y la regulación de genes. FGF21 es una hormona que se induce en el ayuno y que afecta al metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos. Recientemente se han demostrado sus efectos benéficos en la protección de la obesidad inducida por la dieta y en la mejoría en la resistencia a la insulina. En este trabajo hemos demostrado que en células hepáticas en cultivo, SIRT1 desempeña un papel importante en la activación por PPARα de la expresión de FGF21, CPT1A, HMGCS2, y PEPCK. También, que la actividad de SIRT1 regula los niveles de glicemia y la expresión de PCK1 en hígado, en la respuesta al ayuno. Aún así, hemos visto que la actividad de SIRT1 no afecta la expresión de los genes de la oxidación de los ácidos grasos o la cetogénesis en el hígado, en respuesta a diferentes cambios nutricionales, como la restricción calórica, la transición de la lactancia/destete, y el ayuno. Adicionalmente, hemos demostrado que la activación de FGF21 por SIRT1 depende de la actividad HMGCS2. También hemos descrito que FGF21 se induce por la privación de aminoácidos, de manera dependiente de ATF4, y hemos identificado dos elementos de respuesta funcionales en la región promotora del gene humano, altamente conservados entre las especies. Además, hemos demostrado que FGF21 interviene en la regulación del metabolismo de los lípidos en el hígado y el tejido adiposo blanco, y de la termogénesis en el tejido adiposo marrón, durante la privación de aminoácidos. De todas formas, hemos visto que la privación de leucina afecta a los niveles de ácidos grasos libres y cuerpos cetónicos en suero en el estado de alimentación, mientras que no lo hace en el ayuno; y la activación de FGF21 en el ayuno está afectada en los ratones alimentados con esta dieta, desvelando un “crosstalk” entre la señalización del ayuno y la privación de aminoácidos. Thu, 05 Jul 2012 06:48:43 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83459 2012-07-05T06:48:43Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83366 Identificació i caracterització dels enzims implicats en la biosíntesi i degradació de feromones en lepidòpters nocturns Carot Sans, Gerard El conjunt de treballs duts a terme en aquesta tesi tenen per objectiu aprofundir en els mecanismes bioquímics de la comunicació feromonal dels insectes, agafant com a model els lepidòpters nocturns i estudiant-ne tant els aspectes que concerneixen la biosíntesi de llurs feromones com els relacionats amb la seva detecció. Tot i que ambdós processos (biosíntesi i detecció) estan estretament relacionats, s'ha considerat convenient dividir la tesi en dos capítols diferenciats. Així, després d'una introducció general i un capítol de metodologia comú, es presenta un primer capítol destinat a l'estudi d'enzims biosintètics i un segon destinat a l'estudi dels enzims responsables del metabolisme de la feromona un cop aquesta ha activat el receptor olfactiu. Els treballs duts a terme en el primer capítol formen part de la participació del grup en el projecte “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contracte EC: FP6-032275). L'objectiu del projecte era el disseny i implementació d'un dispositiu artificial capaç de mimetitzar la comunicació química dels insectes, agafant com a organisme model l'arna S. littoralis. La participació del nostre grup en el projecte es va centrar en el disseny i la implementació del dispositiu emissor, que pretenia reproduir una part de la ruta biosintètica de la feromona mitjançant la immobilització dels enzims biosintètics en un microreactor. Més enllà d'aquest propòsit, però, es va considerar interessant identificar els ortòlegs de l'insecte utilitzat com a model, la “S. littoralis”, i estudiar la seva influència en la proporció final dels compostos feromonals. Dels enzims de la ruta biosintètica que han estat postulats com a principals responsables de la proporció dels compostos feromonals, la reductasa d'àcids grassos i l'alcohol acetil transferasa no havien estat encara identificats en “S. littoralis” i se'n disposava d'escassa informació en altres insectes. Per aquest motiu es va considerar interessant centrar l'atenció en aquests dos enzims, que d'altra banda eren també els més rellevants per a l'assoliment dels objectius del projecte iCHEM. En el segon capítol es descriuen els treballs duts a terme amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les esterases antenals de lepidòpters nocturns, potencialment implicades en la finalització de l'estímul provocat per la feromona. Per a la realització d'aquests estudis es van escollir dues arnes de la família “Noctuidae”. La primera d'elles, “S. nonagrioides”, constitueix una important plaga dels conreus del blat de moro. La utilització d'inhibidors d'esterases havia resultat prometedora en assajos “in vitro” utilitzant homogeneïtzats de l'antena, així com en assajos d'electrofisiologia duts a terme pel grup (Quero et al. 2003; Quero et al. 2004), però l'absència d'una major informació sobre els enzims diana limitava la millora i optimització d'aquestes molècules amb activitat inhibidora. Pel que fa a la segona espècie escollida (“S. littoralis"), a més de constituir una important plaga arreu del món, oferia l'avantatge de poder ésser criada fàcilment en captivitat, així com el fet de disposar d'abundant informació sobre la seva biologia. Les tasques d'identificació i caracterització d'esterases en les dues espècies es va dur a terme en paral•lel, però degut a les diferències en la quantitat d'informació disponible sobre les dues arnes, es va considerar interessant utilitzar estratègies diferents per a cada insecte.; The set of works presented in this thesis aim to deepen the biochemistry of pheromone communication in insects, taking the moth as a model and investigating the biochemistry aspects of both pheromone biosynthesis and pheromone degradation. Although biosynthesis and degradation are closely related in pheromone biology, the thesis has been divided in two different chapters, the first one concerning the enzymes involved in pheromone biosynthesis and the second one concerning the antennal esterases, involved in pheromone degradation of many moth species. The tasks carried out in the first chapter were part of the European project “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contract EC: FP6-032275). The main role of our group in the iCHEM project was the implementation of an artificial pheromone emitter, that attempted to reproduce part of the biosynthetic route of the pheromone through the immobilization of biosynthetic enzymes in a microreactor. However, beyond this aim, it was considered to be interesting the identification of the orthologues enzymes of “S. littoralis”, and to study the influence of these enzymes in the final proportion of the pheromonal compounds. To this end, the most interesting enzymes of the biosynthetic pathway were selected for DNA isolation, recombinant expression of the protein and biochemical characterisation of the obtained enzyme. The second chapter describes the work carried out in order to deepen the knowledge of antennal esterases of moth, potentially involved in the termination of the stimulus caused by the pheromone. To this end, two moths of Noctuidae family were chosen. The first one, “Sesamia nonagrioides”, is an important pest of corn crops. The use of inhibitors of esterases had promising results “in vitro” assays previously performed using antenna homogenized, however the absence of further information on the target enzymes limited the improvement and optimization of these molecules with inhibitory activity. The second chosen species, “S. littoralis”, besides being a major pest worldwide, offered the advantage of being easily raised in captivity and the availability of abundant information about its biology. The tasks of identification and characterization of esterases in the two species was carried out in parallel, but due to the differences in the information available about two moths, it was considered interesting to use different strategies for each insect. Wed, 04 Jul 2012 07:47:51 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/83366 2012-07-04T07:47:51Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81323 Cancer metastasis as a result of interactions between epithelial and mesenchymal gene programs / Metàstasis del càncer com a resultat d’interaccions entre programes gènics epitelials i mesenquimals Celià Terrassa, Antoni This Doctoral Thesis project is part of a broader research program whose global aim is to better understand key molecular and cellular events in tumor metastasis, in particular those associated with prostate cancer, in order to identify regulatory molecules, gene networks and biochemical pathways, to propose relevant biomarkers and, finally, to provide proof-of-concept validations for potential therapeutic targets. As a starting point, this particular project has relied on comparative analyses between isogenic tumor cells with high vs. low metastatic potentials. The results of this Thesis project are reflected in two different but closely related studies. Article 1, the main publication of this project, focuses on how phenotypic switches and interactions between distinct tumor cell subpopulations engage or suppress metastasis, and which are the genetic programs that may govern such transformations. Article 2 is more focused on specific molecular post-transcriptional regulatory mechanisms that influence the latter steps of metastatic colonization. 1) Malignant progression in cancer requires populations of tumor-initiating cells (TICs) endowed with unlimited self-renewal, survival under stress and establishment of distant metastases. Additionally, the acquisition of invasive properties driven by epithelial-mesenchymal transition (EMT) is critical for the evolution of neoplastic cells into fully metastatic populations. Here we characterize cellular models derived from prostate and bladder cancer cell lines in which tumor subpopulations expressing a strong epithelial gene program are enriched in highly metastatic TICs, while a second subpopulation with stable mesenchymal traits is impoverished in TICs. Constitutive overexpression of the transcription factor Snai1 in the epithelial/TIC-enriched populations engaged a mesenchymal gene program and suppressed their self-renewal and metastatic phenotypes. Conversely, knockdown of EMT factors in the mesenchymal-like prostate cancer cell subpopulation caused a gain in epithelial features and properties of TICs. Both tumor cell subpopulations cooperated among them, such that the non-metastatic mesenchymal-like prostate cancer subpopulation enhanced the in vitro invasiveness of the metastatic epithelial subpopulation and, in vivo, promoted the escape of the latter from primary implantation sites and accelerated their metastatic colonization. Our models provide new insights into how dynamic interactions between epithelial, self-renewal and mesenchymal gene programs determine the plasticity of epithelial tumor-initiating cells. 2) Although the role of miR-200s in regulating E-cadherin expression and epithelial-to-mesenchymal transition is well established, their influence on metastatic colonization remains controversial. Here we have used clinical and experimental models of breast cancer metastasis to discover a pro-metastatic role of miR-200s that goes beyond their regulation of E-cadherin and epithelial phenotype. Overexpression of miR-200s is associated with increased risk of metastasis in breast cancer and promotes metastatic colonization in mouse models, phenotypes that cannot be recapitulated by E-cadherin expression alone. Genomic and proteomic analyses revealed global shifts in gene expression upon miR-200 overexpression toward that of highly metastatic cells. miR-200s promote metastatic colonization partly through direct targeting of Sec23a, which mediates secretion of metastasis-suppressive proteins, including Igfbp4 and Tinagl1, as validated by functional and clinical correlation studies. Overall, these findings suggest a pleiotropic role of miR-200s in promoting metastatic colonization by influencing E-cadherin–dependent epithelial traits and Sec23a-mediated tumor cell secretome. Both studies, when considered together, share important and novel views of metastasis, mainly in relationship with the last steps of the metastatic cascade, strongly suggesting that prostate, bladder and breast tumor cells with an epithelial non-secretory phenotype are more prone to metastatize. We propose that mesenchymal-like tumor cells with a relatively stable EMT derive from epithelial-CSC cells at the primary tumor site, largely in response to microenvironmental influences. As we have shown in the first study, both tumor cell populations, epithelial-CSC or TIC and mesenchymal-like, interact with each other, one consequence being a transient EMT of the epithelial-CSC population that had retained their epithelial state. Thus, in a given tumor microenvironment, there is a strong pressure for epithelial-CSC to drift from epithelial to mesenchymal-like phenotypes. Together, these heterogeneous populations of tumor cells are effective at overcoming the initial barriers to metastasis where invasion is required. After completing these initial steps, mesenchymal-like tumor cell populations are less critically required, while epithelial-CSC are more important and critical to finally grow metastastatic secondary tumors. There are many reasons to support that epithelial-CSC-unsecretory cells are more capable of metastatic colonization, including the facts that they can form clusters in the bloodstream for better survival, are resistant to anoikis, they show anchorage-independent growth and strong self-renewal capacity that permit them to adapt to different environments and initiate and grow secondary tumors. Very interestingly, such cells have a reduced secretion of metastatic suppressor factors which may interact in autocrine and paracrine fashion with tumoral and stromal cells at metastatic sites.; La progressió maligna en càncer requereix de poblacions iniciadores de tumors (TICs) que tenen capacitat auto-renovadora il•limitada, supervivència baix estrès i d'establir metàstasis a distància. Addicionalment, l'adquisició de propietats invasives per transició epiteli-mesènquima (EMT) és crítica per l'evolució neoplàsica en la conversió a poblacions metastàtiques. Aquí caracteritzem models cel•lulars derivats de línies de càncer de pròstata i bufeta, en les quals unes subpoblacions expressen un programa epitelial enriquit en cèl•lules metastàtiques iniciadores de tumors (TICs), mentre que una segona població presenta característiques mesenquimals i és pobre en cèl•lules iniciadores de tumors (TICs). La sobreexpressió constitutiva del factor de transcripció Snai1 en les poblacions enriquides en cèl.lules epitelials-iniciadores de tumors, indueix el fenotip mesenquimal i suprimeix l'auto-renovador i metastàtic. D'altra banda, el knock-down de factors d'EMT en la subpoblació mesenquimal va provocar el guany de propietats epitelials i de cèl•lules iniciadores de tumors. Aquestes dues subpoblacions de càncer de pròstata poden cooperar entre elles. La subpoblació mesenquimal augmenta la seva invasió in vitro de les epitelials-TICs i in vivo promou la seva sortida del lloc de tumor primari accelerant així la colonització metastàtica. Els nostres models proveeixen nous coneixements en com la dinàmica entre programes epitelials auto-renovadors i mesenquimals, determinen la plasticitat de les cèl•lules epitelials iniciadores de tumors Wed, 23 May 2012 07:25:58 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81323 2012-05-23T07:25:58Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/79172 Study of the physiological function of carnitine palmitoyltransferase 1C enzyme Carrasco Rodríguez, Patricia Carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) enzymes catalyze the conversion of long-chain acyl-CoA to acyl-carnitines, thus facilitating the entry of long-chain fatty acids to the mitochondria, where they undergo β-oxidation. There are three isoforms: the liver isoform CPT1A (Esser, V. 1993), the muscle isoform CPT1B (Yamazaki, N. 1995) and the brain-specific isoform CPT1C (Price, N. 2002). CPT1A and CPT1B are localized in the outer mitochondrial membrane and are rate-limiting enzymes in fatty-acid β-oxidation. The CPT1C isoform, was first described in 2002, is expressed exclusively in the central nervous system, with a homogeneous distribution in all areas such as hippocampus, cortex, hypothalamus, cerebellum and others. CPT1C enzyme highly differs from the two other isozymes. Its C-terminal region is longer than that of the other CPTs (Price, N. 2002). It is located in the endoplasmic reticulum (ER) of cells, rather than in mitochondria, and so it does not facilitate fatty acid oxidation (Sierra, A.Y. 2008). Analysis of amino sequence of CPT1C reveals that all important residues for CPT1 activity are conserved in CPT1C enzyme, despite this, no catalytic activity was found (Price, N. 2002; Wolfgang, M.J. 2006), but it binds the CPT1 physiological inhibitor malonyl-CoA with the same affinity as CPT1A (Wolfgang, M.J. 2006). Finally, CPT1C is only present in mammals and appears to stem from a relatively recent CPT1A gene duplication (Price, N. 2002). The other isozymes are expressed in such organisms as fish, reptiles, amphibians or insects. This suggests a specific role for CPT1C in more evolved brains. At the physiological level, CPT1C contributes to the control of food intake and energy homeostasis (Wolfgang, M.J. 2006; Gao, X.F. 2009). Two independent groups developed a CPT1C-KO mouse, and both lines showed decreased food intake respect to wild-type animals (WT). However, when fed a high-fat diet, they were more susceptible to obesity and diabetes, presenting lower rates of peripheral fatty acid oxidation. All these effects were attributed to the hypothalamic function of CPT1C, since ectopic over-expression of CPT1C in hypothalamus protected mice from adverse weight gain caused by high-fat diet (Dai, Y. 2007). Moreover, the involvement of CPT1C in energy homeostasis has also been confirmed in transgenic animals over-expressing CPT1C specifically in brain (Reamy, A.A. 2011). At the molecular level, in collaboration with the group of Dr. Gary Lopaschuk, we showed that CPT1C is involved in the anorectic action of leptin, by modulating ceramide synthesis in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus (Gao, S. 2011). Interestingly, recent findings in tumor cells showed a new, unexpected role of CPT1C in the metabolic transformations reported in tumor cell growth (Zaugg, K. 2011). The authors demonstrated that CPT1C is frequently expressed in human lung tumors and protects cancerous cells from death induced by glucose deprivation or hypoxia. The results suggest that CPT1C might provide unidentified fatty-acid derived products that would be beneficial for cell survival under metabolic stress. However, despite these recent findings about CPT1C, little is known about its catalytic activity or its physiological function in other brain areas. We demonstrate that CPT1C has low CPT1 activity although it has similar affinity for its substrates: carnitine and palmitoyl-CoA than CPT1A isoform. The present study also shows that CPT1-KO mice have reduced long-chain acyl-carnitine levels in the hippocampus, hypothalamus or cerebellum. We examined whether CPT1C is expressed in the peripheral nervous system: in the ventral horn of the spinal cord (motor neurons) and in the sensitive ganglions, in addition to the brain. We found that CPT1C is expressed in both regions, albeit at lower levels than in the brain. We also examined CPT1C expression along mouse development, and we found that CPT1C protein expression is present in early stage of embryos at day 15, is increased postnatally and reaches its expression peak in adulthood. Moreover, CPT1C is expressed in pyramidal neurons of hippocampus and is located in ER throughout the neuron, even inside dendritic spines. We used molecular, cellular and behavioral approaches to determine CPT1C function. First, we analyzed the implication of CPT1C in ceramide metabolism. CPT1C over-expression in primary hippocampal cultured neurons increased ceramide levels, an effect that was blocked by treatment with myriocin, an inhibitor of the de novo synthesis of ceramide. Correspondingly, CPT1C knock-out (KO) mice showed reduced ceramide levels in hippocampus, cerebellum, striatum and motor cortex, mainly during fasting. At the cellular level, CPT1C deficiency altered dendritic spine morphology by increasing immature filopodia and reducing mature mushroom and stubby spines. Total protrusion density and spine head area in mature spines were unaffected. Treatment of cultured neurons with exogenous ceramide reverted the KO phenotype, as did ectopic over-expression of CPT1C, indicating that CPT1C regulation of spine maturation is mediated by ceramide. To study the repercussions of the KO phenotype on cognition and motor function, we performed the hippocampus-dependent Morris Water Maze (MWM) test and some motor tests on mice. Results show that CPT1C-KO mice are hypoactive and exhibit clear deficits in motor function, especially in coordination skills and strength. Moreover, CPT1C deficiency strongly impairs spatial learning without affecting memory or cognitive flexibility. So, all these results demonstrate that CPT1C regulates the de novo synthesis of ceramide in ER of hippocampal neurons and this is a relevant mechanism for the correct maturation of dendritic spines and for proper spatial learning.; ESTUDIO DE LA FUNCIÓN FISIOLÓGICA DE LA ENZIMA CPT1C La isoforma carnitina palmitoil transferasa 1C (CPT1C) se expresa únicamente en cerebro y ha sido implicada en la regulación hipotalámica de la ingesta de alimentos y la homeostasis energética. No obstante, su función molecular y su papel en otras áreas del cerebro son desconocidas. Hemos demostrado que CPT1C se expresa en las neuronas piramidales del hipocampo y se localiza en el retículo endoplásmico a lo largo de la neurona, incluso dentro de las espinas dendríticas. Hemos utilizado métodos moleculares, celulares y conductuales para determinar la función de CPT1C. En primer lugar, analizamos la implicación de CPT1C en el metabolismo de la ceramida. La sobre-expresión de CPT1C en neuronas de hipocampo aumentó los niveles de ceramidas, un efecto que fue bloqueado por el tratamiento con miriocina, un inhibidor de la síntesis de novo de la ceramida. En consecuencia, los ratones CPT1C knock-out (CPT1C-KO) demostraron una reducción de los niveles de ceramidas en el hipocampo, cerebelo, estriado y corteza motora principalmente durante el ayuno. A nivel celular, la deficiencia en CPT1C afecta a la morfología de las espinas dendríticas mediante el aumento de filopodios inmaduros y reduciendo el número de espinas maduras. La densidad de protrusiones totales o el área de la cabeza de la espinas dendrítica no se vieron afectadas. El tratamiento de las neuronas en cultivo con ceramida exógena, como la sobre-expresión ectópica de CPT1C, revirtieron el fenotipo de las espinas CPT1C-KO, lo que indica que CPT1C regula la maduración de las espinas dendríticas a través de las ceramidas. Para estudiar las repercusiones del fenotipo CPT1C-KO en la cognición y en la habilidad motora se realizaron diferentes test conductuales. Los resultados del test cognitivo demostraron que la deficiencia de CPT1C perjudica al aprendizaje espacial. Por otra parte, la realización de test motores demostraron que los ratones CPT1C son hipoactivos y tienen disminuida tanto la coordinación motora como la fuerza muscular. Todos estos resultados demuestran que CPT1C regula la síntesis de novo de ceramidas en el retículo endoplásmico de las neuronas y éste es un mecanismo necesario para la correcta maduración de las espinas dendríticas y para el adecuado procedimiento del aprendizaje espacial y la función motora. Tue, 10 Apr 2012 07:04:02 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/79172 2012-04-10T07:04:02Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78903 Papel de la carnitina palmitoiltransferasa 1A hipotalámica en el control de la ingesta Mera Nanín, Paula La elevada incidencia de la obesidad y las enfermedades relacionadas han convertido en una prioridad el estudio de los mecanismos destinados a controlar la ingesta y el gasto calórico. Ambos procesos están regulados por las interacciones bidireccionales entre el sistema nervioso central y los órganos periféricos, las cuales permiten crear un mapa del estado energético del organismo y responder en consecuencia ajustando tanto el consumo de alimentos como el gasto de energía. El hipotálamo es una parte del sistema nervioso central con un papel protagonista en el control de la homeostasis energética. Es una estructura integradora de señales centrales y periféricas implicada en la regulación de varios procesos, entre otros, el apetito. Durante los últimos años, múltiples estudios han tratado de profundizar en los mecanismos moleculares que, en el hipotálamo, controlan la expresión de los neuropéptidos y neuromoduladores encargados de regular la ingesta. Como resultado se ha demostrado el papel clave que juega el metabolismo de los ácidos grasos en estos procesos. Concretamente, se ha propuesto que moléculas como el malonil-CoA derivado de la glucosa, o los aciles-CoA de cadena larga (LCFA-CoA, long chain fatty acyl-CoA) actúan como señales intracelulares de saciedad regulando el apetito. El enzima carnitina palmitoiltransferasa (CPT) 1, cataliza la entrada de LCFA-CoA al interior de la mitocondria, y es el principal regulador de la oxidación de ácidos grasos. A su vez, su actividad se encuentra inhibida por el primer intermediario de la lipogénesis, el malonil-CoA, lo que permite mantener un equilibrio entre la síntesis y la oxidación de las grasas. En esta Tesis se ha estudiado el efecto que la modulación de CPT1 en el hipotálamo tiene sobre la ingesta de alimentos. Para ello se han utilizado dos aproximaciones experimentales diferentes. En primer lugar se ha sobre expresado una isoforma permanentemente activa del enzima (CPT1AM) en el núcleo ventromedial del hipotálamo. En segundo lugar se ha estudiado el efecto de la administración central del compuesto anorexigénico C75 que, una vez activado a C75-CoA, actúa como potente inhibidor de CPT1. Los resultados obtenidos demuestran que la sobre-expresión de CPT1AM en el hipotálamo causa inicialmente hiperfagia y, en un estado posterior, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa e hiperglucemia. Por otro lado, la inhibición de CPT1 en el hipotálamo tras el tratamiento con C75 produce una disminución de la ingesta y una pérdida de peso aportando nuevas pistas sobre el mecanismo de acción central de C75. Tomados en conjunto, estos resultados confirman el importante papel que el enzima CPT1 juega en la regulación del apetito. Asimismo, aportan nuevos datos sobre los mecanismos centrales que modulan el metabolismo glucídico. Por otro lado demuestran que la inhibición de CPT1 a nivel central se deriva en una disminución de la ingesta resaltando la importancia de este enzima como diana terapéutica para el tratamiento de la obesidad.; “Role of hypothalamic carnitine palmotoyltransferase 1A in the control of food intake” Neutral energy balance permits body weight stability and prevents the emergence of diseases such as obesity and Type 2 Diabetes. Central nervous system (CNS) and more specifically the hypothalamus, has a key role in the regulation of homeostatic mechanisms that control food consumption. In response to changes in global energy status, hypothalamic neurons alter the expression of neuropeptides in order to adjust energy intake and expenditure. It is unclear how the expression of these molecules is regulated; however recent studies highlight fatty acid metabolism as a key pathway in hypothalamic control of feeding. Several studies have demonstrated that modulation of fatty acid metabolic enzymes can regulate feeding behaviour by altering the hypothalamic pool of malonyl-CoA and/or long chain fatty acid-CoA (LCFA-CoA), suggesting that these metabolites are signals of nutrient status able to adjust not only food intake but also energy expenditure and glucose production. Malonyl-CoA, derived from glucose metabolism, is not only the first intermediate in fatty acid synthesis but also has a role in the maintenance of balance between de novo synthesis of fatty acids and its oxidation. Malonyl-CoA is the physiological inhibitor of carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1), enzyme that catalyses the first step in the transport of LCFA-CoA from the cytoplasm into the mitochondria for their b-oxidation. In the present study we analysed the role of hypothalamic CPT1A in the regulation of food intake. To this aim we used two experimental strategies. On the one hand, we over-expressed a permanently active form of CPT1A (CPT1AM: malonyl-CoAinsensitive-CPT1A) in the VMH of rats and studied its effect on food intake, body weight and glucose metabolism. On the other hand we studied the molecular mechanism by which compound C75 produces anorexia and a reduction in body weight, focusing our attention on its effect on hypothalamic CPT1 activity. Our results show that a long-term increase in CPT1AM activity in the VMH of rats leads to central and peripheral responses producing hyperphagia, overweight, insulin resistance and glucose intolerance. On the other hand we demonstrated that only (+)-C75 enantiomer inhibits CPT1 activity and its central administration produces a reduction in food intake and body weight. Altogether these data emphasizes the role of hypothalamic CPT1 in the maintenance of energy homeostasis and highlights its inhibitors as good candidates for the treatment of obesity and related diseases. Fri, 23 Mar 2012 07:20:33 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78903 2012-03-23T07:20:33Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78902 Estudi de l’estat de seleni en sang i en líquid cefaloraquidi de pacients pediàtrics amb malalties neurològiques Tondo i Colomer, Mireia L’objectiu principal d’aquesta tesis doctoral ha estat estudiar l’estat del Se en sang i LCR de pacients amb errors congènits del metabolisme amb tractament dietètic i altres trastorns neuropediàtrics de diferent etiologia. En el primer treball ens plantejàvem l’establiment de valors de referència per a determinats elements traça en sang total. La necessitat venia de la inexistència d’estudis sobre l’estat d’aquests elements en poblacions pediàtriques afectades de diferents errors congènits del metabolisme. En el segon treball ens plantejàvem l’establiment de valors de referència per a seleni en LCR. La necessitat venia de la inexistència d’estudis sobre l’estat d’aquest element en poblacions pediàtriques i de la possible associació entre una alteració de l’estat de Seleni i algunes disfuncions neurològiques. Un cop establerts els valors de referència de Se en LCR, el tercer treball consistia en valorar l’estat de Se en pacients amb malalties neurològiques per intentar detectar alguna deficiència o excés de Se en els líquids d’aquests pacients. A part de valorar l’estat de Se, preteníem valorar també altres paràmetres bioquímiques com HVA, 5-MTHF, 5-HIAA, proteïnes, activitat de GPx i pterines, per tal de veure si les correlacions observades en l’anterior treball es mantenien. Finalment, l’últim treball es centrava en l’estudi d’un grup de pacients amb uns valors de Se en LCR permanentment elevats sense tenir-ne una explicació clara. Aquests pacients (que s’havien identificat en el tercer treball) estaven afectats de la síndrome de Kearns-Sayre (malaltia mitocondrial que es manifesta per deleció del DNA mitocondrial). En aquest nou treball ens plantejàvem l’estudi d’uns paràmetres bioquímics que ens permetessin detectar la disfunció del plexe coroïdal en pacients afectats d’aquesta síndrome. Així doncs i a títol de discussió, una de les nostres principals necessitats pel control regular dels pacients amb malalties metabòliques i tractament dietètic era la monitorització de diferents elements traça en diferents fluids biològics. Tradicionalment s’havia descrit deficiències d’alguns d’aquests elements en pacients que tenen com a base del seu tractament les dietes restrictives. De tots els elements, el Se semblava un candidat ideal, ja que prèviament s’havien descrit deficiències en algunes malalties, com la fenilcetonúria.La importància del Se radica en que és un element essencial per al correcte funcionament de les selenoproteïnes. Per tant, ens semblava d’interès monitoritzar les concentracions de Se tant en sang (com a marcador de dèficit nutricional) com en LCR (com a marcador potencial de mecanismes fisiopatològics en malalties d’àmbit neuropediàtric). Les fites més importants del nostre treball han estat tres: 1. L’estandardització del procediment en sang ha permès establir la tècnica de forma rutinària per al control de trastorns nutricionals al nostre centre. Des d’un punt de vista científic, la conclusió més important és que el dèficit de seleni és comú a les malalties metabòliques amb tractament dietètic i que per tant el seu estudi i suplementació són necessàries per a l’òptim control de les malalties. 2. Respecte a l’estudi del seleni a nivell central, les aportacions han estat més rellevants ja que era un camp poc estudiat. Hem establert per primera vegada valors normals de Se en LCR per a una població pediàtrica i confirmat que el cervell es un òrgan que regula mot bé l’homeòstasi d’aquest element traça, ja que els valors eren independents dels observats en sang. 3. Especialment rellevant creiem que és el perfil que ens va permetre valorar la funció del plexe coroïdal en la síndrome de KSS i el diagnòstic directe d’un cas. Aquest resultats no tan sols tenen un valor per a la pràctica diagnòstica, sinó que obren la porta a la investigació d’altres malalties en les que s’afecta el plexe coroïdal.; PhD STUDENT NAME Mireia Tondo Colomer TESIS TITLE Blood and cerebrospinal fluid selenium status in paediatric patients affected with neurological diseases. SUMMARY Our objective was to study blood and CSF Se status in patients with IEM with dietary treatment and other neurological disorders with different clinical aetiology. In this first study our objective was the establishment of reference values for some trace elements in whole blood. At that time, studies of several trace element status for a paediatric population with different inborn errors of metabolism were scarce. To achieve this aim, we used an Induced Couple Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS), which allowed multiple analyses of different trace elements using a small sample volume. Leftover samples form patients who came to our hospital for minor surgery were used as reference population. In this second study our objective was the establishment of cerebrospinal fluid selenium reference values. At that time, no previous studies of Se central nervous system status for a paediatric population existed in the scientific literature. CSF Se concentrations had to be considered in order to find out any possible association between Se status and some neurological functions. Moreover, the implications of Se in the synthesis and function of more than 20 selenoproteins indicated that central nervous system Se status was important. After the establishment of CSF Se reference values for a paediatric population, the next step was to evaluate Se CSF concentrations in paediatric patients with different neurological disorders. Previous studies demonstrated the tight regulation of Se homeostasis in brain as well as the evidence of the role of Se in CNS disorder pathophysiology. In spite of growing evidence of the role of Se in CNS, no studies of Se CNS status in a large cohort of paediatric patients affected with different neurological disorders had been carried out. Finally, our last study derived from the one before which allowed us to identify a group of patients with clearly high CSF Se values. The main common feature was that all patients had a mitochondrial DNA deletion syndrome (Kearns Sayre Syndrome). This group of patients was not included in the previous work and was treated separately. Fri, 23 Mar 2012 07:18:24 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78902 2012-03-23T07:18:24Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77951 Determinants de la unió a glicogen i translocació de la glicogen sintasa Martínez Pons, Carlos La glicogen sintasa (GS) és un enzim cabdal en el metabolisme de carbohidrats, catalitzant l’addició d’un residu glicosil a l’extrem no reductor d’una cadena de glicogen preexistent. Les GSs eucariotes són enzims altament regulats, tant per al•losterisme com per fosforilació. Gràcies a diferents estructures de GSs resoltes en els darrers anys ja es té una idea aproximada el mecanisme enzimàtic de la reacció, així com els llocs d’unió de la molècula donadora del grup glicosil UDP-glucosa. Tot i que experimentalment es coneix la gran afinitat entre la GS i el glicogen, l’acceptor en la reacció catalítica, se sap poc de la interacció d’ambdós. En el nostre laboratori es va identificar un lloc d’unió a carbohidrats a la superfície de la GS de l’arqueó Pyrococcus abyssi (PaGS) gràcies a la resolució de l’estructura cristal•logràfica d’aquest enzim unit a una molècula de maltohexaosa. En aquesta tesi es demostra que aquest lloc d’unió a carbohidrats de PaGS es tracta d’un lloc d’unió a glicogen funcional ja que, quan el modifiquem per mutagènesi, l’enzim perd la seva capacitat d’unió al glicogen. Aquesta pèrdua d’afinitat té un impacte directe sobre l’eficiència catalítica de PaGS a l’hora d’utilitzar glicogen com a substrat. Per alineament de seqüències deduïm una possible conservació d’aquest lloc d’unió en la glicogen sintasa muscular humana (HMGS). La mutació d’aquest domini de la HMGS resulta en una disminució de l’afinitat per glicogen de l’enzim, un canvi en la seva localització subcel•lular i un clar impacte en la capacitat de l’enzim per acumular glicogen in vivo. D’aquesta manera identifiquem fins a cinc residus aminoacídics, tots allunyats del centre actiu, la mutació dels quals disminueix l’afinitat de l’enzim pel glicogen i que formarien, per tant, part d’un nou lloc d’unió a glicogen no catalític en la HMGS, que es mostra com un element regulador crític responsable de l’eficiència catalítica de l’enzim in vivo. Una vegada establerta la importància del domini d’unió a glicogen en HMGS, mesurem l’afinitat de la isoforma hepàtica de la glicogen sintasa humana (HLGS) pel glicogen. Tot i que ambdues isoformes de la GS humana tenen una alta identitat en la seva seqüència d’aminoàcids, els resultats mostren que HLGS té una menor afinitat pel glicogen. No hem pogut identificar els residus responsables d’aquest canvi d’afinitat. Al nostre laboratori es va descriure per primera vegada com la HMGS transloca al nucli cel•lular quan exhaureix els seus reservoris de glicogen. Els mutants de HMGS que no s’uneixen al glicogen també transloquen al nucli cel•lular, confirmant el glicogen com a únic factor de retenció citoplasmàtic de HMGS. Finalment, en aquesta tesi també s’intenta deduir si la localització nuclear de HMGS té algun paper biològic. Hem aconseguit identificar tres proteïnes que col•localitzen al nucli cel•lular amb HMGS, i que tenen en comú la seva capacitat d’unió a ARN. Hem observat com la incubació amb l’inhibidor de la transcripción actinomicina D de cèl•lules amb HMGS nuclear fa que l’enzim transloqui a la perifèria nucleolar, comportament descrit per moltes altres proteïnes que uneixen ARN. Finalment, un assaig in vitro d’unió entre HMGS i ARN apunta a la possible interacció entre ambdós. Totes aquestes evidències recolzen una possible funció nuclear per a la HMGS.; Thesis title: “Determinants of glycogen binding and translocation of glycogen synthase”. Author: Carlos Martínez Pons. ABSTRACT Glycogen is a glucose polymer synthesized by the cell to store large amounts of glucose and is subsequently mobilized when energy demand increases. The importance of glycogen is reflected in its conservation among archaea, bacteria and eukarya. The glycogen granule is considered as a finely regulated organelle, with most of its proteins locating at the granule thanks to a direct interaction with glycogen through a carbohydrate-binding site. But it still remains unclear if these sites have other implications on protein regulation and catalytic performance. In this thesis we structurally identify a functional non-catalytic glycogenbinding site on a key enzyme of glycogen metabolism. When we mutate this carbohydrate-binding site we observe an alteration of the subcellular distribution of the enzyme and, moreover, a dramatic decrease of its catalytic performance, showing that the glycogen-binding site is not only used to remain bound at the glycogen granule, but that it is necessary for the proper functioning of the enzyme. Tue, 06 Mar 2012 11:15:53 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77951 2012-03-06T11:15:53Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77950 Producció de proteïnes recombinants mitjançant la tecnologia Zera® en diferents sistemes eucariotes: desenvolupament d’estratègies de processament. Pallissé Bergwerf, Roser ERA Biotech S.A. és una empresa que desenvolupa la seva pròpia tecnologia per a la producció de proteïnes i pèptids d’alt valor afegit. El mètode de producció i acumulació de proteïna recombinant es basa en el mecanisme natural d’acumulació de proteïnes de reserva de blat de moro (zeïnes) en orgànuls densos derivats de reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics. La tecnologia Zera® empra el domini ric en prolina de l’extrem N-terminal de la γ-zeïna per induir la formació de novo de cossos proteics heteròlegs en teixits i cèl•lules eucariotes. L’elevada densitat que presenten aquests orgànuls permet una recuperació i enriquiment de la proteïna de fusió d’interès, mitjançant tècniques d’homogeneïtzació i fraccionament cel•lular. Originàriament dissenyats per permetre la purificació per afinitat del proteïna d’interès, els elements de fusió també poden ajudar a mantenir l’estabilitat, el plegament i la solubilitat del producte. Malgrat tot, per a algunes aplicacions posteriors es requereix la producció de la proteïna nativa, amb el qual són necessàries etapes de proteòlisi mitjançant endoproteases específiques. En un context industrial l’addició d’una proteasa exògena suposa l’etapa més costosa en el procés de producció. A més, les condicions de processament poden arribar a interferir amb l’activitat biològica del component purificat. Un dels objectius principals de moltes empreses dedicades a la producció de proteïnes recombinants, tracta de cercar alternatives al processament convencional per addició de proteases exògenes. L’objectiu general d’aquest treball s’ha centrat en el desenvolupament i aplicació de dues estratègies de processament aplicades a proteïnes recombinants de fusió produïdes mitjançant la tecnologia Zera®, en diferents sistemes d’expressió. La primera aproximació ha consistit en la producció d’enteroquinasa bovina (EK), endoproteasa específica, mitjançant la tecnologia Zera®. La producció d’enteroquinasa pròpia evitaria l’adquisició comercial de la mateixa, amb el qual es reduirien els costos globals de producció. S’han dissenyat diferents construccions amb el domini catalític de l’enteroquinasa fusionat al domini Zera® per tal de permetre la seva acumulació en cossos proteics heteròlegs. Degut a la conformació catalítica que adopta, observàrem que el seu extrem N-terminal havia de romandre lliure per tal de mantenir la seva activitat proteolítica. La fusió del domini Zera® al extrem C-terminal d’EK va resultar incompatible amb la viabilitat de les cèl•lules de mamífer o del teixit foliar de tabac, indicant cert grau de citotoxicitat promogut per la proteasa activa. D’altra banda, el bloqueig de l’extrem N-terminal d’EK mitjançant la fusió del domini Zera®, requeria d’una etapa prèvia de processament per tal d’activar la proteasa in vitro. Els baixos nivells d’expressió assolits en cèl•lules de mamífer, juntament amb la baixa idoneïtat de l’estratègia, varen motivar l’exploració d’altres alternatives de processament. La segona aproximació descrita en aquest treball es basa en l’estudi de l’autoprocessament de proteïnes de fusió mitjançant inteïnes. Les inteïnes són elements proteics naturals capaços de promoure l’splicing de proteïnes a través d’una sèrie de reaccions que permeten la seva auto-excissió i la unió dels fragments que les flanquegen o exteïnes. Certes modificacions genètiques en residus clau de la seqüència de les inteïnes, han permès modular la seva activitat per permetre l’autoprocessament in vitro de forma controlable. S’ha estudiat l’aplicació de dos tipus diferents d’inteïnes induïbles per al processament de proteïnes de fusió Zera®, en cèl•lules de mamífer, en cèl•lules d’insecte, i en planta de tabac. El rendiment global del procés de producció de rhGH (com a proteïna model), fou analitzat i comparat emprant dos sistemes de processament diferents sobre la proteïna de fusió Zera® expressada en planta de tabac: el mediat per la inteïna MxeGyrA, i el de la proteasa comercial enteroquinasa. Tot i que els costos globals de producció de rhGH resultaren similars per ambdós processos, el rendiment de producció fou notòriament major en el procés emprant la inteïna. L’èxit de l’aplicació de les inteïnes a la tecnologia Zera®, ha comportat un avenç en el procés de downstream, facilitant de manera significativa la recuperació de la proteïna nativa d’interès.; ERA Biotech S.A. is a biotechnology company whose technology permits high-level production of recombinant proteins and peptides through application of the Zera® assembler peptide. The Zera® domain originates from a maize storage protein (gamma-zein), which naturally accumulates in maize grains in the form of dense protein bodies to elevated levels. The Zera® assembler peptide when fused to a protein of interest triggers the formation in vivo of protein bodies in eukaryotic cells, effectively converting the cells into dense storage organelles. Due to its physicochemical properties, the downstream steps and recovery of the recombinant proteins are extremely efficient. For some applications in the biopharmaceutical industry, fusion or affinity tags need to be cleaved off by site-specific endoproteases in order to recover the native target protein. At a manufacturing scale, the removal of the fusion tag is the most costly step in protein production (cost and specificity/efficiency issues), and can interfere with the biological activity of the purified component. Therefore novel cleavage options which permit specific, efficient and scalable protein production processes are required. In the present study we describe two different cleavage strategies that have been adopted for Zera® fusion proteins expressed in different host expression systems. The first approach was to produce a conventional site-specific endoprotease in house through Zera® technology. Different constructs were designed for the easy and active production of bovine enterokinase (EK) catalytic subunit in mammalian cells and transgenic tobacco plants. Active conformation of this protease was adopted when the N-terminus of the protein was free of any fusion tag, however, proteolytic activity of this protease resulted in cytotoxicity in both host cell systems tested. The fusion of the Zera® domain in the N-terminus of EK and its expression in mammalian cells resulted in the formation de novo of protein bodies accumulating the target fusion protein. Isolation of protein bodies and subsequent downstream steps for protein recovery were designed and set up for this new host system. For the EK activation, a cleavage step by another endoprotease was included, but the low expression levels achieved for this fusion protein, resulted in non-conlcusive data from the activity test. Considering the biochemical properties of this protease its recombinant production for large scale manufacturing results technically cost-unfriendly, so alternative cleavage methods were explored. The second approach described in the present work, consisted in the use and application of self-cleavable elements for the specific cleavage of Zera® fusion proteins. Inteins are naturally occurring protein elements capable of post-translational self-excission from a precursor protein through a process known as protein splicing. MxeGyrA and SspDnaB mini-inteins have been engineered to yield a controllable N-terminal and C-terminal autocleavage induced under certain controlled conditions. Both inteins have shown activity when fused to Zera® and to a protein of interest in mammalian cells (CHO), insect cells (Sf9) and transgenic tobacco plants. The success of the intein application to the Zera® technology has evolved into a faster and more user friendly downstream step leading to the recovery of a native protein of interest. Tue, 06 Mar 2012 10:36:09 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77950 2012-03-06T10:36:09Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/53504 Desenvolupament i Aplicació de Bioassaigs per a la Monitorització Ambiental de Lligands del Receptor d’hidrocarburs d’Aril (AhR, Compostos Tipus Dioxina) Olivares Polo, Alba Els contaminants ambientals capaços d’unir-se al Receptor d’hidrocarburs d’Aril i induir la seva activació ectòpica són molt diversos i es troben àmpliament distribuïts per tota la biosfera. L’exposició continuada a aquest tipus de compostos s’ha vist relacionada amb l’augment de malalties cardiovasculars i càncer, entre d’altres efectes adversos. D’aquesta manera, la seva monitorització en zones amb fonts de contaminación continues és necessària per tal d’assegurar que no es sobrepassen els límits establerts. La utilització de bioassaigs per a determinar l’activitat tipus dioxina dels contaminants. a més de la seva composició química, permet una valoració més acurada dels riscos que representen. Aquesta tesis presenta com a objectius el disseny i la validació de bioassaigs basats en un llevat recombinant i embrions de peix zebra que permeten, en el cas dels llevat, una valoració ràpida i econòmica i, en el cas de l’embrió de peix zebra, un estudi més complert i amb la possibilitat d’observar efectes adversos directes. Per tal de dur a terme la seva validació. aquests bioassaigs es van utilitzar en diversos estudis medi ambientals de zones possiblement contaminades per compostos tipus dioxina (PAHs, Organoclorats, etc.) que representen les diferents tipus de matrius on es solen trobar aquests contaminants: sediment fluvial (part baixa del riu Ebre, des de l’Embassament de Flix fins a la desembocadura) i marí (Estuari d’Urdaibai), particulat de l’aire (Vall del Po, al nord d’Itàlia) i sòl (residus miners al districte de Datong a Xina). Els resultats d’aquests estudis han permès establir els nivells de contaminació de cada zona així com observar que la resposta obtinguda pels nostres bioassaigs té un perfil similar a l’observada per altres bioassaigs ja establerts així com amb la composició química. A més, destaquen la importància de combinar l’anàlisi química amb l’activitat biològica per tal d’obtenir una informació més complerta sobre compostos que no s’han tingut en compte o que es desconeix la seva presència a les mostres.; Title: Development and application of bioassays for environmental monitoring Aryl hydrocarbon Receptor ligands (AhR, dioxin-like compounds). Environmental pollutants able to bind and induce ectopic activation of the Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) are diverse and widely distributed throughout the biosphere. Continuous exposure to these compounds has been associated with increased cardiovascular disease and cancer, among other effects. Thus, their monitoring in potentially polluted areas is still necessary to ensure that safety limits are not exceeded. The use of bioassays to determine dioxin-like activity, along with chemical analysis, allow an accurate assessment of the risks they represent. This thesis presents the design, objectives and validation of bioassays based on a recombinant yeast and zebrafish embryos that allow, in the case of yeast, a rapid and economic assessment and, in the case of the zebrafish embryo, a more complete one and with the possibility of observing direct effects. To perform validation, these bioassays were used in studies of environmental areas presumably contaminated by dioxin-like compounds (PAHs, Chlorinated, etc..) that represent different types of matrices where these contaminants are found: fluvial sediment (lower part of the river Ebro, from the Flix Dam to the mouth) and marine (estuary Urdaibai), particulate air (Po Valley, northern Italy) and soil (mining waste in the district of Datong in China). The results of these studies have established pollutions levels present in each area and show a correlation with chemical data as well as a similar response between our bioassays and other more standardized. Besides, those results highlight the importance of combining chemical and biological analysis in order to obtain a complete information of the samples. Mon, 23 Jan 2012 10:06:18 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/53504 2012-01-23T10:06:18Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52173 Control transcripcional i caracterització molecular de l’alanina aminotransferasa mitocondrial en l’orada (Sparus aurata) Salgado Martín, María del Carmen Els peixos carnívors presenten baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats i per mantenir la glucèmia. En aquests organismes, la baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats condueix a estats d’hiperglicèmia més marcats i sostinguts que els descrits per a mamífers, després de l’administració de glucosa o la ingesta de dietes amb elevat contingut de carbohidrats. L’alanina aminotransferasa (ALT) catalitza la transaminació reversible entre L-alanina i α-cetoglutarat per formar L-glutamat i piruvat. Mitjançant la interconversió d’aquests quatre metabòlits, l’ALT esdevé un nexe d’unió entre el metabolisme d’aminoàcids i el de carbohidrats. En estudis previs del nostre grup es va descriure la presència de tres isoformes ALT en S. aurata, els isoenzims citosòlics, cALT1 i cALT2, i la isoforma mitocondrial mALT. L’expressió hepàtica de cALT2 incrementa en situacions gluconeogèniques, mentre que la de cALT1 és predominant durant el període postprandial per a l’utilització dels nutrients de la dieta. L’objectiu d’aquest treball és incrementar el coneixement del metabolisme intermediari en peixos i així permetre realitzar futures intervencions biotecnològiques amb la intenció de millorar la utilització metabòlica dels nutrients de la dieta. Per comprendre millor la funció d’mALT vam estudiar la distribució tissular, la caracterització cinètica i la regulació nutricional i hormonal de l’expressió d’mALT en S. aurata. Addicionalment, vam analitzar l’expressió tissular i la regulació hormonal dels enzims aspartat aminotransferasa mitocondrial (AST2), glutamat deshidrogenasa (GDH) i glutamina sintetasa (GlnS), relacionats tots ells amb el metabolisme d’aminoàcids. En orades alimentades, mALT, GDH i GlnS s’expressen majoritàriment a fetge, intestí i ronyó. Els nostres estudis indiquen que l’expressió de mALT, GDH, AST2 i GlnS és elevada en animals alimentats, mentre que disminueix en condicions associades amb la gluconegènesi, com ara el dejú i el tractament amb estreptozotocina (STZ). Estudis cinètics de l’activitat enzimàtica mALT indiquen que l’enzim catalitza de manera més eficient la conversió d’L-alanina a piruvat, que no pas la reacció inversa. Per conèixer el mecanisme molecular implicat en la regulació transcripcional de l’expressió d’mALT, vam aïllar el promotor mALT d’orada, i vam mostrar que HNF4α incrementa la transcipció d’mALT per unió a una caixa HRE. El dejú i l’administració d’STZ disminuïren els nivells d’HNF4α en ronyó d’S. aurata, portant a un descens en la transcripció d’mALT. Els nostres resultats suggereixen que HNF4α té un paper important en la regulació transcripcional del gen mALT en ronyó d’S. aurata. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que mALT i cALT1, que presenten una distribució tissular i un patró d’expressió en dejú i tractament amb STZ similars, podrien cooperar per direccionar els aminoàcids de la dieta al mitocondri per destinar-los a l’obtenció d’energia. Per tant, ALT es podria utilitzar com a diana per realitzar una intervenció biotecnològica a fi de reduir la utilització de proteïnes amb finalitats energètiques i optimitzar així l’ús dels nutrients de la dieta en el cultiu de peixos.; Carnivorous fish have poor ability to use dietary carbohydrates and to control the blood glucose levels. Compared with mammals, these animals show prolonged hyperglycemia after a glucose load or when feeding on high carbohydrate diets. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalyzing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Our group, in previous studies showed the presence of three ALT isoforms in Sparus aurata: the cytosolic isoenzymes cALT1 and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In fish liver, increased expression of cALT2 is associated to enhanced gluconeogenesis while cALT1 is predominant during the postprandial utilization of dietary nutrients. The aim of the present study was to increase the current knowledge of fish intermediary metabolism to allow future biotechnological actions in order to improve metabolic utilization of dietary nutrients. To better understand the functional role of mALT we analysed the tissue distribution, kinetic characterization and nutritional and hormonal regulation of mALT expression in S. aurata. Furthermore, cloning and characterization of the mALT promoter was also addressed. Additionally, tissue expression and nutritional regulation of glutamate dehydrogenase (GDH), mitochondrial aspartate aminotransferase (AST2) and glutamine synthetase (GlnS), also involved in amino acid metabolism, was followed. In S. aurata under feeding conditions, mALT, GDH and GlnS are mainly expressed in liver, intestine and kidney. Our studies indicate that the expression of mALT, GDH, AST2 and GlnS is increased in fed animals, while decreased in conditions associated with gluconeogenesis, such as fasting or treatment with streptozotocin (STZ). Kinetic analysis of mALT enzyme activity indicated that this enzyme catalyses more efficiently the conversion of L-alanine to pyruvate than the reverse reaction. To understand the molecular mechanism underlying the transcriptional regulation of mALT expression, we isolated the S. aurata mALT promoter, and showed that HNF4α enhances mALT transcription through binding to an HRE box. Starvation and administration of STZ decreased HNF4α levels in the kidney of S. aurata, leading to downregulation of mALT transcription. Our results suggest that HNF4α may play an important role in the transcriptional regulation of mALT gene in kidney of S. aurata. In conclusion, our findings suggest that mALT and cALT1, which present a similar tissue distribution and pattern expression under starvation and STZ-treatment, can cooperate to redirect dietary amino acids to the mitochondria for energetic pourposes. This points to ALT as a target for a biotechnological action to spare protein and optimize the use of dietary nutrients for fish culture. Thu, 15 Dec 2011 08:21:57 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52173 2011-12-15T08:21:57Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/32127 Proteïnes d’Escherichia coli implicades en el diàleg amb l’enteròcit: Caracterització del regulador transcripcional LldR i de la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa extracel.lular Aguilera Gil, Maria Laura El tracte gastrointestinal de l’individu humà es troba colonitzat per la microbiota intestinal. L’epiteli intestinal actua com a barrera física per impedir que els bacteris accedeixin a òrgans essencials, i representa la superfície on l’hoste pot interaccionar amb el bacteri. Independentment de si el balanç final d’aquesta interacció és positiu o negatiu, la gran pressió selectiva que té lloc en la interfase bacteri-hoste determina que ambdues parts hagin desenvolupat múltiples maneres de comunicar-se. En aquest treball s’han abordat dos aspectes relacionats amb la interacció bacteri-hoste. Per una banda, com a model d’adaptació metabòlica durant l’adhesió d’Escherichia coli a enteròcits, s’ha estudiat la regulació de l’operó lldPRD. Per altra banda, s’ha aprofundit en l’estudi dels mecanismes de secreció de la proteïna multifuncional gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) de soques patògenes i probiòtiques com a mecanisme que el bacteri utilitza per interaccionar amb l’hoste. En referència a l’adaptació metabòlica d’E. coli durant l’adhesió, s’ha seleccionat un dels gens sobreexpressats en E. coli enterohemorràgica (EHEC) adherida a membranes plasmàtiques d’eritròcits, el gen lldR (Dahan i col, 2004). lldR codifica la proteïna reguladora de l’operó lldPRD, responsable del metabolisme d’L-lactat en E. coli, però no es tenen evidències experimentals sobre la regulació d’aquest operó. En aquesta tesi s’ha assignat a LldR un paper dual com a activador de la transcripció en presència d’L-lactat en el medi, i com a repressor en absència d’aquest, a través de la formació d’un bucle de DNA format mitjançant la unió d’LldR a dues seqüències operadores. El fet que l’operó lldPRD, estigui sobreexpressat en bacteris adherits podria representar un mecanisme pel qual el bacteri s’adapta a l’augment local de la concentració d’L-lactat a la superfície intestinal, contribuint a l’establiment d’una relació entre l’enterobacteri i l’a cèl·lula hoste. Pel que fa als mecanismes de secreció i interaccions de la GAPDH bacteriana amb l’hoste, prèviament s’havia identificat aquesta proteïna com a secretada per soques patògenes EHEC i EPEC (E. coli enteropatògena) crescudes en determinats medis de cultiu. En el present treball s’ha determinat la participació de dos mecanismes de secreció alternatius, el de tipus injectisoma (T3aSS), actiu en soques patògenes en medi de cultiu eucariota, i un altre mecanisme encara per identificar, actiu en soques patògenes i probiòtiques (E. coli Nissle 1917) en medi de cultiu bacteriològic ric. No es detecta secreció de GAPDH en soques aïllades naturals no patògenes com EcoR26, indicant que la secreció i/o exposició de la proteïna a la superfície representa un avantatge pels bacteris patògens i probiòtics en termes d’adhesió i colonització. Així, s’ha determinat la capacitat d’unió de la GAPDH a fibrinogen i plasminogen. Addicionalment, la GAPDH pot tenir altres funcions en la relació amb l’hoste. En aquest estudi s’ha determinat la capacitat de la GAPDH de ser internalitzada en la cèl·lula eucariota en forma de vesícules. També és possible que la proteïna sigui translocada al citoplasma de la cèl·lula hoste a través del T3SS. En aquest treball, s’ha observat la interacció de GAPDH amb els factors d’elongació de la traducció EF1Bγ i EF1Bα de l’enteròcit. Finalment, en aquest estudi s’ha comprovat la capacitat de la proteïna GAPDH de ser ADP-ribosilada. La GAPDH, però, també té activitat ADPribosiltransferasa, fet que podria determinar la seva participació en la modificació de proteïnes de l’hoste en el cas de ser translocada al citoplasma de la cèl·lula eucariota. En el context de la comunicació o diàleg entre el bacteri i l’hoste colonitzat, els resultats d’aquest treball ajuden a entendre alguns dels mecanismes pels quals les soques d’E. coli patògenes i/o probiòtiques s’adapten a l’entorn intestinal i s’adhereixen a l’epiteli més eficaçment que els bacteris que no presenten aquests mecanismes.; Human gastrointestinal tract is colonized by intestinal microbiota. The intestinal epithelium acts as a physical barrier and represents the area where host-bacteria interaction occurs. The selective pressure in this interface determines that both parties have developed many ways to communicate. In this work we have addressed two aspects of host-bacteria interaction. As a model for metabolic adaptation of Escherichia coli adherence to enterocyte, we have studied the regulation of lldPRD operon. As a mechanism that bacteria use to interact with the host, we have analysed the secretion mechanisms of the multifunctional protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of pathogenic and probiotic strains. lldR encodes the regulator protein of the lldPRD operon, which is responsible for the metabolism of L-lactate in E. coli. We have demonstrated that LldR plays a dual role as an activator of transcription of the operon in the presence of L-lactate, and as a repressor in absence of the inducer through the binding of LldR to two operator sequences and the formation of a DNA loop. The fact that the lldPRD operon is overexpressed in attached bacteria might be a mechanism used by bacteria to adapt to increased local concentration of L-lactate on the intestinal surface. We have determined the participation of two alternative mechanisms in bacterial GAPDH secretion. The T3SS injectisome is active in pathogenic strains growing in eukaryotic culture medium. Another mechanism is active in pathogenic and probiotic strains (E. coli Nissle 1917) growing in rich bacteriological medium. No secretion was detected in natural non-pathogenic isolates, indicating that secretion or exposure of the protein on the surface confers advantages to pathogenic and probiotic bacteria in terms of adhesion and colonization. We have also determined that GAPDH binds fibrinogen and plasminogen. Moreover, we have demonstrated that GAPDH possesses ADPrybosiltranferase activity, which might determine its participation in the modification of host proteins when translocated to the cytoplasm of eukaryotic cells. In the context of host-bacteria communication, these results provide insight into the adaptation mechanisms that allow some pathogenic and/or probiotic E. coli strains to adapt more effectively to the intestinal environment than bacteria lacking these mechanisms. Wed, 13 Jul 2011 11:26:00 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/32127 2011-07-13T11:26:00Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/32118 Anàlisi del fenotip resultant de la modificació de l’expressió del gen 3-Hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa mitocondrial Vilà Brau, Anna La cetogènesi és el procés mitocondrial pel qual es sintetitzen els cossos cetònics (acetoacetat, 3-hidroxibutirat i acetona) a partir de l’acetil-CoA provinent de la degradació dels àcids grassos. És un procés mitocondrial i l’enzim clau de la via és la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa mitocondrial (HMGCS2). La regulació de l’HMGCS2 ha estat àmpliament estudiada i es coneixen les hormones (glucagó, insulina, dexametasona), situacions metabòliques (dieta grassa, dejuni-realimentació, lactància, exercici perllongat) o patològiques (diabetis) que la regulen. Durant la darrera dècada s’atribueix als cossos cetònics un paper com a molècules senyalitzadores. Per tal d’aprofundir en l’estudi d’aquest paper, en la present tesi doctoral ens hem plantejat estudiar les conseqüències de la modificació de l’expressió del gen HMGCS2. Amb aquest objectiu, hem realitzat experiments en cèl·lules HepG2 de sobreexpressió i disminució de l’expressió del gen HMGCS2 que ens han permès demostrar que l’HMGCS2 és necessària per la inducció de l’oxidació d’àcids grassos mitjançada per PPARα. També hem demostrat que l’HMGCS2 regula positivament l’expressió d’FGF21, un gen diana de PPARα implicat en l’homeòstasi energètica per un mecanisme que implica la sirtuina SIRT1. D’altra banda, s’ha reduït l’expressió del gen HMGCS2 en ratolins de forma aguda mitjançant la injecció d’adenovirus codificants per shRNAs i se n’ha analitzat el fenotip. S’ha identificat, mitjançant un anàlisi massiu d’expressió gènica, el gen Fat specific protein 27 (Fsp27/CIDEC), una proteïna implicada en la formació de gotes lipídiques, com a potencial gen diana de l’HMGCS2. Finalment, s’ha aprofundit en els mecanismes de regulació del gen Fsp27/CIDEC demostrant que aquest s’indueix fortament durant el dejuni a nivell hepàtic.; Ketogenesis is a mitochodrial pathway by which ketone bodies (acetoacetat, 3-hydroxybutyrate and acetone) are syntesized from the acetyl- CoA comming from fatty acid oxidation. The key enzyme of this pathway is mitochondrial 3-hydroxy-3-metylglutaryl-CoA synthase (HMGCS2). The regulation of HMGCS2 has been widely studied: it is known that hormones (glucagon, insulin, dexamethasone), metabolic situations (dietary fat, fastfeeding, lactation, prolonged exercise) or pathologies (diabetes) regulate its expression. During the last decade, evidence is emerging that ketone bodies could act as signaling molecules. To further study this role, in this thesis we studied the consequences of the modification of HMGCS2 gene expression. To this end, we performed experiments in HepG2 cells by overexpression and down regulation of HMGCS2 gene, which allowed us to demonstrate that HMGCS2 is necessary for the induction of fatty acid oxidation mediated by PPARα. We have also shown that HMGCS2 positively regulates the expression of FGF21, a PPARα target gene involved in energy homeostasis by a mechanism that involves sirtuin SIRT1. On the other hand, we have down regulated HMGCS2 acutely in mice by injection of adenovirus encoding for shRNAs and we have analysed the phenotype of these mice. Through a massive analysis of gene expression, we have identified Fat specific protein 27 (Fsp27/CIDEC), a protein involved in the formation of lipid droplets, as a potential target of HMGCS2. Finally, we explored the mechanisms of Fsp27/CIDEC gene regulation demonstrating that it is strongly induced during fasting in liver. Tue, 12 Jul 2011 11:17:54 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/32118 2011-07-12T11:17:54Z