TDX/TDR - Departament de Genètica

Análisis de las interacciones moleculares de la toxina Cry3Aa de Bacillus thuringiensis en la membrana del epitelio intestinal de Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata)

Mon, 28 May 2012 10:51:14 GMT

Análisis de las interacciones moleculares de la toxina Cry3Aa de Bacillus thuringiensis en la membrana del epitelio intestinal de Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata) Ochoa Campuzano, Camila Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata) es el insecto defoliador de patata de mayor importancia económica a nivel mundial, que también puede atacar otras plantas de interés económico como berenjena y tomate, y que ha desarrollado resistencia frente a un gran número de los insecticidas químicos utilizados para combatirlo. Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis, las cuales son altamente específicas para sus dianas e inocuas para los vertebrados, la gran mayoría de los invertebrados y las plantas, constituyen una herramienta de gran valor para el control de esta plaga, sin provocar efectos perjudiciales sobre el medio ambiente. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio del modo de acción de la toxina Cry3Aa de B. thuringiensis en L. decemlineata, centrándonos en los eventos que tienen lugar como consecuencia de su interacción con la membrana del epitelio intestinal. Hemos encontrado que la toxina Cry3Aa interactúa con proteínas localizadas tanto en los lipid rafts como fuera de estos microdominios de membrana, entre las que hemos identificado, por homología de secuencia, las proteínas prohibitina-1 y -2, RACK1, anexina, actina, y V-ATPasa, proteínas cuya interacción con Cry3Aa no había sido descrita, ni se habían previamente identificado en L. decemlineata. Como resultado de su interacción con la membrana del epitelio intestinal, la toxina Cry3Aa se proteoliza por proteasas asociadas a dicha membrana. La proteólisis tiene lugar por regiones expuestas del dominio III de Cry3Aa y es catalizada por cisteín proteasas de la familia de las intestaínas y por metaloproteasas probablemente de la familia de las ADAM. El reconocimiento de la toxina Cry3Aa por las metaloproteasas ADAM debe producirse a través de una secuencia localizada en el lazo 1 del dominio II. Mediante el análisis de la influencia de moduladores de la actividad proteolítica de metaloproteasas ADAM en la proteólisis de la toxina Cry3Aa, catalizada por vesículas de la membrana del borde en cepillo del epitelio intestinal, comprobamos que el compuesto extractor de colesterol MCD disminuye la proteólisis de la toxina y el inhibidor de calmodulina TFP produce su incremento. La unión de la proteína calmodulina a Cry3Aa impide la proteólisis de la toxina catalizada por las metaloproteasas ADAM asociadas a la membrana. Desde el punto de vista funcional, el procesado proteolítico de la toxina Cry3Aa catalizado por las metaloproteasas de tipo ADAM es necesario para su toxicidad en células disociadas del epitelio intestinal y en larvas de L. decemlineata.; The Colorado potato beetle (CPB), Leptinotarsa decemlineata (Say) is an exceptionally destructive insect pest for potato, tomato, eggplant and other solanaceous crops, responsible of important economic losses in agriculture, which to date has developed resistance to a wide variety of synthetic chemical insecticides. Bacillus thuringiensis (Bt) Cry3Aa toxin based bioinsecticides, which are highly specific, safe for users and the environment, represent a viable alternative for the biological control of this important agricultural pest. In the present work we have deepened in the study of Bt Cry3Aa toxin mode of action in CPB, focusing in the analysis of Cry3Aa toxin interaction with CPB midgut epithelium membrane. We have found that Cry3Aa toxin binds to both lipid rafts and non-rafts membrane associated proteins, among them, we have identified by sequence homology the proteins prohibitins-1 and -2, RACK1, annexin, actin and V-ATPase, which interaction with Cry3Aa toxin or identification in CPB, have not been previously reported. As a result of Cry3Aa interaction with CPB midgut epithelium, the toxin is proteolyzed by membrane associated proteases. Cry3Aa toxin proteolysis takes place in domain III exposed regions and it is catalyzed by digestive cysteine proteases intestains and metalloproteases probably belonging to the ADAM family. CPB ADAM like metalloproteases must recognize Cry3Aa toxin by a region located in loop I of domain II. The analysis of the influence of modulators of ADAM metalloprotease activity in Cry3Aa proteolysis, catalyzed by midgut brush border membrane vesicles, shows that the cholesterol extracting compound MCD decreases Cry3Aa proteolysis and the calmodulin inhibitor TFP enhances proteolysis. Cry3Aa binding to calmodulin prevents toxin proteolysis catalyzed by CPB ADAM like metalloproteases. From a functional standpoint, Cry3Aa toxin proteolysis catalyzed by CPB ADAM like metalloproteases is a key event in Cry3Aa toxicity against CPB larvae and dissociated midgut epithelium cells.

Análisis funcional de Cabut, un factor de transcripción implicado en el cierre dorsal de Drosophila

Tue, 15 May 2012 11:09:59 GMT

Análisis funcional de Cabut, un factor de transcripción implicado en el cierre dorsal de Drosophila Belacortu Pastor, Yaiza El cierre dorsal (CD) es uno de los últimos procesos morfogenéticos de la embriogénesis de Drosophila y que consiste en el cierre del agujero más dorsal que presenta el embrión durante el estadio 13 de su desarrollo. Para ello, las capas epiteliales laterales migran mientras que la amnioserosa se contrae e invagina. Este proceso necesita de la coordinación de la epidermis, la amnioserosa y el vitelo, así como de reestructuraciones en el citoesqueleto celular, la polarización de las células epidérmicas más dorsales, la formación de filopodios y lamelipodios y la activación de rutas de transducción de señal como la de las JNKs. El CD es el proceso más estudiado de la extensión y fusión de epitelios y comparte muchas similitudes con el proceso de curación de heridas en vertebrados. cabut (cbt), es un gen que codifica un factor de transcripción necesario para que se produzca el CD. cbt se expresa en la epidermis y el vitelo actuando bajo el control de las JNKs y regulando la expresión del gen decapentaplegic en el leading edge. Las proteínas ortólogas a Cbt en vertebrados pertenecen a la familia de factores de transcripción TIEG, que han sido descritos como inhibidores de la proliferación celular y asociados a diferentes tipos de procesos cancerosos. Cbt está relacionado con otros procesos como el ciclo circadiano, la regeneración de discos imaginales, el control del ciclo celular, el crecimiento celular, la remodelación neuroendocrina y la respuesta a la ecdisona la guía de axones y sinaptogénesis. En esta tesis doctoral se han generado diferentes herramientas genéticas, bioquímicas e inmunológicas para poder realizar diferentes aproximaciones que nos lleven a dilucidar cuales son las funciones de Cbt durante el desarrollo embrionario así como sus dianas transcripcionales y cuales son los dominios funcionales responsables de su actividad. Para ello se generó un anticuerpo que reconoce de forma específica a Cbt y se realizaron ensayos de Inmunodetección así como de Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP‐on‐chip). Esto ha permitió realizar un estudio amplio del patrón de expresión embrionario de la proteína, tanto durante el CD como en otros estadios del desarrollo, demostrando que Cbt no solo se expresa en los núcleos de la epidermis, el vitelo y el intestino posterior durante el CD, sino también en los núcleos de la amnioserosa a través de la ruta de las JNKs. Además se han descrito nuevos patrones de expresión de Cbt en embriones tempranos, en el sistema nervioso central y periférico embrionario‐larvario sugiriendo nuevas funciones de esta proteína. A nivel estructural y mediante ensayos en cultivo celular, se ha determinado que la señal de transporte al núcleo de Cbt se encuentra en el N‐terminal y corresponde al motivo 71PNKKPRL77, siendo imprescindibles para este transporte las lisinas K73K74. Además, se ha podido determinar que, al igual que las proteínas TIEG, Cbt puede actuar como activador y/o represora de la transcricpión. Por último, mediante microarrays en embriones mutantes cbt durante el CD, hemos demostrado que la expresión de Cbt en la epidermis está regulada por la ruta de señalización de la ecdisona y que, a su vez, Cbt regula la expresión de más de 1000 genes entre los que se encuentran Tm2, InR, fas y los genes inducibles por ecdisona ImpE1 e ImpL1. Asímismo, los ensayos de ChIP‐on‐chip han mostrado que Cbt es capaz de unirse a varias regiones genómicas entre las que se encuentran su propio promotor y el promotor del gen NPC1a, implicado en el tráfico de lípidos. Estos resultados sugieren que la ecdisona está implicada en el CD, a través de Cbt, y que el transporte de lípidos podría tener un papel importante en el mismo; cabut (cbt) encodes a transcription factor involved in Drosophila dorsal closure (DC), and it is expressed in embryonic epithelial sheets and yolk cells during this process upon activation of the Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway. Additional studies suggest that cbt may have a role in multiple developmental processes, such as neuroendocrine cell remodeling, ecdysone response, circadian rhythm, axon guidance, synaptogenesis, cell growth and cell cycle. The vertebrate orthologes of Cbt, the family of TIEG transcription factors, are involved in proliferation and cancer. In this thesis, we have generated different genetic, biochemical and immunological tools for the study of the function of Cbt during fly development, its transcriptinal targets and the structural domains responsible for its function. To analyze Cbt subcellular localization throughout embryogenesis, as well as Cbt´s transcriptional targets, we generated a Cbt-specific antibody that allowed us to (1) detect new Cbt expression patterns and (2) perform Chromatin Immunoprecipitation assays followed by microarray analyses (ChIP-on-chip). Immunohistochemical analyses during DC revealed that Cbt is expressed in the yolk, epidermal and amnioserosal cells, which contribute to the DC process. Also, Cbt is expressed in the central and peripheral nervous system. Moreover, cell culture assays have determinated that the 71PNKKPRL77 motif of Cbt functions as a nuclear localization signal (NLS), and that the conserved TIEG´s NLS, is not functional in insects. Direct mutagensis demonstrated that K73 and K74 residues are necessary for Cbt transport to the nucleus. Whole embryo microarray analyses of cbt mutants during DC were performed, and they revealed that Cbt regulates more than 1000 genes during the DC process, such as the 20-hydroxyecdysone hormone (20E)-inducible genes ImpE1 and ImpL1. Indeed, 20E regulates Cbt in the epidermis. Finally, ChIP-on-chip studies showed direct binding of Cbt to genomic regions close to Cbt and NPC1a (Niemann-Pick Type C-1) genes, which regulate trafficking of sterols through endocytic/secretory pathway. Taken together, these results suggest that 20E and lipid trafficking are involved in the DC through Cbt.

Genome evolution and systems biology in bacterial endosymbionts of insects

Thu, 02 Feb 2012 12:01:55 GMT

Genome evolution and systems biology in bacterial endosymbionts of insects Belda Cuesta, Eugeni Gene loss is the most important event in the process of genome reduction that appears associated with bacterial endosymbionts of insects. These small genomes were derived features evolved from ancestral prokaryotes with larger genome sizes, consequence of a massive process of genome reduction due to drastic changes in the ecological conditions and evolutionary pressures acting on these prokaryotic lineages during their ecological transition to host-dependent lifestyle. In the present thesis, the process of genome reduction is studied from different perspectives. In the first chapter, genome rearrangements have been studied in a set of 31 complete γ-proteobacterial genomes that includes five genomes of bacterial endosymbionts of insects. This is carried out by comparing the order of a subset of 244 single-copy orthologous genes presents in all the genomes and calculating the number of inversions and breakpoints between each genome pair. This reveals that inversions were the main rearrangement event in γ-proteobacteria evolution, with a progressive increase in the number of rearrangements with increased evolutionary distance. However, significant heterogeneity in different γ-proteobacterial lineages was also detected, with a significant acceleration in the rates of genome rearrangements in bacterial endosymbionts of insects at initial stages of the association. In the second chapter, the structure and functional capabilities of Sodalis glossinidius has been studied. S. glossinidius is the secondary endosymbiont of tsetse flies, and it´s at very initial stages of genome reduction process. It´s genome is experiencing a massive process of gene inactivation, with 972 pseudogenes (inactivated genes) that were described but not annotated in the original annotation of the genome. In this chapter, a complete functional re-annotation of this genome was carried out, that includes the characterization of 1501 pseudogenes though analysis of S. glossinidius intergenic regions. A massive presence of CDSs related with mobile genetic elements and surface proteins were detected, being also the functional classes most affected by pseudogenization. The reconstruction of the metabolic map of S. glossinidius revealed a functional profile very similar to that of free-living enterics, with inactivation of L-arginine biosynthesis pathway, whereas the comparison with Wigglesworthia glossinidia (tsetse primary endosymbiont) reveals possible cases of metabolic complementation between both tsetse endosymbionts at thiamine, coenzyme A and tetrahydrofolate biosynthesis level. Finally, in the third chapter of the thesis, the complete reductive evolution process associated with S. glossinidius was studied from a systems biology perspective through the reconstruction of their genome-scale metabolic networks at different stages of this process and the prediction of their internal reaction fluxes under different external conditions through Flux Balance Analysis. This revealed the decisive role of the pseudogenization of genes involved in L-arginine and glycogen biosynthesis and specially the pseudogenization of the key anaplerotic enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase in the ecological transition to a host-dependent lifestyle experienced by S. glossinidius. A progressive decrease in network robustness to gene deletion events and to changes in particular reaction fluxes were detected. Finally, reductive evolution simulations over the functional network of S. glossinidius under different external conditions revealed a higher plasticity in minimal networks evolved in a nutrient-rich environment, and allow defining different sets of essential and disposable genes based on their presence or absence in minimal metabolic networks. These essential genes had more optimized patterns of codon usage and more restricted patterns of sequence evolution than disposable genes that could be lost without affecting the functionality of the network. However, lineage-specific estimates of dN and dS in S. glossinidius and Escherichia coli revealed that common features of ancient bacterial endosymbionts like acceleration in the rates of sequence evolution and the loss of adaptative codon usage were starting to affect S. glossinidius evolution.; En esta tesis doctoral, el proceso de reducción genómica característico de bacterias endosimbiontes de insectos ha sido estudiado utilizando diferentes aproximaciones computacionales basadas en la genómica comparada y la biología de sistemas. Por un lado, las dinámicas de reordenaciones genómicas han sido estudiadas en un subconjunto de 31 genomas completos de γ-proteobacterias que incluyen 5 genomas completos de endosimbiontes bacterianos de insectos, revelando una aceleración significativa de las tasas de reordenaciones en estos genomas en etapas iniciales del proceso de reducción. Posteriormente, el genoma de Sodalis glossinidius, el endosimbionte secundario de la mosca tsétsé, fue re-anotado con el objetivo de evaluar el impacto de los procesos de inactivación génica y proliferación de elementos genéticos móviles en etapas tempranas del proceso de reducción, asi como su impacto sobre las capacidades funcionales de la bacteria en el contexto ecológico de su coexistencia con el endosimbionte primario ancestral Wigglesworthia glossinidia. Finalmente, el proceso completo de reducción genómica en S. glossinidius ha sido estudiado a través de la reconstrucción de su red metabólica a diferentes etapas de este proceso y su análisis funcional mediante Análisis de Balance de Flujos, evaluando la robustez de las redes frente a sucesos de deleción asi como las dinámicas evolutivas de genes esenciales y no esenciales en base a su presencia en redes mínimas evolucionadas a partir de la red funcional. Este análisis permitió identificar sucesos de inactivación génica con efectos drásticos sobre las capacidades funcionales del sistema como los genes implicados en la biosíntesis de arginina y glicógeno, y especialmente la inactivación de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa, asi como una disminución progresiva de la robustez de las redes frente a diferentes sucesos mutacionales asociada al proceso de pérdida génica. Finalmente, simulaciones de evolución reductiva sobre la red funcional bajo diferentes condiciones de entorno ha permitido definir conjuntos de genes esenciales y delecionables en base a su presencia o ausencia en las redes mínimas producto de las simulaciones, revelando una mayor conservación a nivel de secuencia y un uso de codones más optimizado en genes esenciales frente a genes cuya pérdida no afecta a la funcionalidad del sistema.

Variabilidad genética y evolución del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en procesos de transmisión

Thu, 13 Oct 2011 12:03:12 GMT

Variabilidad genética y evolución del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en procesos de transmisión Moya Gay, Patricia Los aislados de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia, que se generan mediante procesos de mutación y recombinación. Su frecuencia en la población es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética, generalmente asociados a los procesos de transmisión. El objetivo de esta tesis era analizar por separado el efecto de diversos factores de los procesos de transmisión sobre la estructura poblacional y la diversidad genética de distintos aislados del virus. Se analizó el efecto de la transmisión por pulgón. Ésta ocurrió con baja eficiencia y en general, las secuencias de los genes analizados en las plantas receptoras fueron idénticas a las de las plantas donantes y el aislado de colección. La transmisión por injerto y/o pulgón supone un cuello de botella que puede dar lugar a un efecto fundador. Se analizó el efecto de la transmisión por injerto entre plantas de una misma especie huésped y no se observaron cambios llamativos en la estructura y diversidad poblacional. También se estudió si la transmisión por injerto de dos aislados de CTV a diferentes especies y variedades comerciales propagadas sobre citrange Carrizo podía inducir cambios en la población. Aunque no observamos cambios significativos en la diversidad genética, la estructura poblacional se vio alterada en algunas plantas. Esta alteración fue debida a la aparición de nuevas variantes de secuencia cercanas filogenéticamente que llegaban a predominar en dichas poblaciones. Finalmente, se utilizó un aislado clonal de CTV para el estudio de la variación genética de novo en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. Se efectuaron pases sucesivos por injerto de dicho aislado desde su huésped original a distintos huéspedes susceptibles, y a un huésped parcialmente resistente (naranjo amargo). Las poblaciones en los huéspedes susceptibles presentaron una elevada estabilidad, pero los pases sucesivos en el huésped naranjo amargo dieron lugar a cambios importantes en la población, debido a la aparición de variantes de secuencias muy divergentes anteriormente halladas en dos aislados naturales del virus. La detección de secuencias minoritarias cuya posición filogenética se sitúa entre los tres genotipos avala la idea de una evolución entre el genotipo original y los otros dos detectados para intentar adaptarse al huésped. El hallazgo de secuencias recombinantes entre los tres genotipos apoya la presencia de éstos en el huésped naranjo amargo. La inoculación de huéspedes susceptibles a partir de plantas de naranjo amargo puso de manifiesto la progresiva pérdida de infectividad de la población mantenida en esta especie, debido en parte a la baja acumulación de CTV en la misma. Además fue imposible detectar el virus en brotes de lima propagados sobre estas plantas, lo que sugiere que además del bajo título viral algún factor del huésped pudiese dificultar el paso de CTV desde naranjo amargo a lima.; CTV isolates are composed of a population of sequence variants, resulting from mutation and recombination events. The frequency of these variants in the population is the outcome of different selective pressures, and migration and genetic drift phenomena generally associated to transmission processes. Here we analyzed separately the effect of different factors of the transmission process on the diversity and population structure of CTV isolates. We studied the effect of aphid transmission by nucleotide sequence comparisons between the donor and receptor plants and the collection CTV isolate. Transmission efficiency was low, and no sequence variation was observed. Aphid and graft transmission are a bottleneck resulting in a founder effect. We analysed the effect of graft transmission to a host of the same species. No obvious changes were observed in the CTV population structure and diversity We also studied if graft-transmission to different varieties propagated on Carrizo citrange could alter the CTV population. Although significant diversity changes were not observed, the population structure was occasionally altered due to the appearance of new sequence variants genetically close that became predominant in these populations. Finally, we used a clonal CTV isolate to study genetic variation generated de novo in different hosts. This isolate was serially passed by graft-transmission in different susceptible hosts and in a partially resistant host (sour orange). While CTV population was stable in the susceptible hosts, passages through sour orange caused major changes due to the appearance of new diverged sequence variants previously found in two natural isolates). Detection of minor variants phylogenetically located between these three genotypes supports the idea of an evolutionary process between the original and two new genotypes to get adapted to sour orange. Recombination events involving the three genotypes supports the presence of more than one genotype in infected sour orange. Inoculation from sour orange to susceptible hosts showed progressive loss of infectivity, due in part to the low virus titer in this host. CTV could neither be detected in Mexican lime propagated on these sour orange plants, suggesting that some host factor might also block CTV movement from sour orange to lime.

Gen FOXP2: Esquizofrenia, alucinaciones auditivas y lenguaje.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:38 GMT

Gen FOXP2: Esquizofrenia, alucinaciones auditivas y lenguaje. Tolosa Montero, Mª Amparo La presente tesis se ha centrado en la evaluación a través de diferentes aproximaciones de la implicación del gen FOXP2, gen sometido a selección positiva en el linaje humano y relacionado directamente con una alteración de uno de los rasgos más característicos de la especie humana, el lenguaje, en la vulnerabilidad a la esquizofrenia.

El estudio de asociación caso-control no ha permitido establecer una implicación consistente entre las variantes estructurales analizadas (SNPs y posibles expansiones de trinucleótidos) con las alucinaciones auditivas como fenotipo alternativo a la esquizofrenia. No obstante, la participación del gen FOXP2 en la vulnerabilidad a las alucinaciones auditivas, como componente referido al lenguaje no puede descartarse por completo, ya que el SNP rs2396753 mostró una tendencia hacia la significación y el SNP rs2253478 mostró diferencias significativas para el ítem de Pobreza del Lenguaje de la Escala Manchester.

El análisis de la región promotora nos ha permitido valorar que la regulación de la expresión del gen debe ser más compleja de lo que inicialmente se esperaba.
El análisis evolutivo muestra que diferentes tramos de la región promotora analizada han evolucionado diferencialmente, encontrándose una región altamente conservada, que curiosamente no parece contener una elevada concentración de sitios de unión a factores de transcripción, como sería lo esperado dada su posible importancia funcional. Esta secuencia se localiza inmediatamente aguas arriba del potencial promotor extraído de las bases de datos mediante herramientas bioinformáticas. Bajo la hipótesis de su pertenencia al núcleo central del promotor, la evaluación funcional de esta región conservada indica que posiblemente contenga elementos represores de la transcripción, al menos en el tipo celular testado, esto es, células procedentes del pulmón, ya que se obtienen mayores niveles de expresión en su ausencia.

Dentro de la hipótesis epigenética de la esquizofrenia se llevó a cabo un análisis de los patrones de metilación en dos fragmentos incluidos en una isla CG adyacente al primer exón, no traducido, del gen en tejidos postmorten de pacientes esquizofrénicos y controles. En primer lugar se obtuvo una clara diferencia en el grado de metilación entre el fragmento analizado localizado aguas arriba del primer exón, con ausencia de metilación respecto al localizado aguas abajo, para el que se obtuvieron patrones específicos de metilación. Comparando el grado de metilación en diferentes áreas cerebrales en pacientes con esquizofrenia y controles, se observó que en la circunvolución del parahipocampo el grado de metilación es mayor que en las otras áreas analizadas y además hay indicios de diferencias entre ambos grupos analizados en ambos hemisferios. Los análisis de expresión encaminados a determinar si el grado de de metilación estaba correlacionado con los niveles de expresión no permitieron llegar a resultados concluyentes al respecto.

Otro gen de gran interés en la evolución de la especie humana es el gen HAR1A el cual se caracteriza por incluir una región con evolución acelerada en el linaje humano. Se consideró que un gen de las características del gen HAR1A podría constituir también un buen gen candidato para la esquizofrenia, por lo que se llevó un estudio caso control de las mismas características que el realizado con el gen FOXP2. El hecho de no encontrar diferencias significativas en las frecuencias genotípicas, alélicas o haplotípicas en el estudio de asociación caso-control llevado a cabo con el gen HAR1A indica que no parece estar relacionado con la vulnerabilidad a la esquizofrenia, aunque podría estar relacionado con la susceptibilidad a padecer alucinaciones auditivas dentro del contexto psicótico, al obtenerse diferencias globales en la comparación de haplotipos entre pacientes alucinadores y pacientes sin alucinaciones.; This thesis has focused in the study of FOXP2 gene, which is the first gene related to a language disorder and which has been subject to positive selection in human lineage, as candidate gene for schizophrenia through different approaches
Case-control study didn't allow establishing a consistent relationship between the analyzed structural variants (SNPs and trinucleotide repetitions) and auditory hallucination as alternative phenotype for schizophrenia. Nevertheless, a role of FOXP2 in vulnerability to schizophrenia through its relationship with language cannot be ruled out since SNP rs2396753 showed a trend to significance and SNP rs2253478 showed significative differences for Poverty of Speech.
Analysis of promoter region suggests regulation of the expression of the gene is more complex than it was initially expected.
Evolutionary analysis of a 6Kb fragment surrounding first exon of the gene revealed different evolutionary rates in different fragments as well as some potential promoter regions. A highly conserved region was detected upstream of the annotated promoter. In order to determine if this highly conserved region should be included in the promoter core functional analyses were performed. These experiments indicated that this region probably contains repressor elements.
Under the epigenetic hypothesis of the origin of schizophrenia an analysis of the methylation patterns of a CpG island adjacent to first untranslated was performed. Differences between upstream and downstream region were detected as well as differences for methylation of parahippocampal gyrus in patients and controls and between hemispheres. Quantification of mRNA levels was conducted in order to correlate methylation and expression levels of the gene, with inconclusive results.
As a summary, with our results we cannot rule out a role of FOXP2 in the susceptibility to schizophrenia, although no direct evidence has been obtained.

Bases genéticas de la esquizofrenia: aspectos emocionales, cognitivos y neuroanatómicos.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:38 GMT

Bases genéticas de la esquizofrenia: aspectos emocionales, cognitivos y neuroanatómicos. Rivero Martín, Olga María La esquizofrenia es un desorden mental severo, con una incidencia del 1% y una elevada heredabilidad (alrededor del 80%). Por ello, hay un enorme interés en conocer los factores genéticos implicados en la vulnerabilidad a padecer esquizofrenia. Sin embargo, esta enfermedad presenta una herencia poligénica y además un importante número de factores ambientales parecen influir en su aparición. Asimismo, la heterogeneidad clínica también es elevada y esto dificulta el tener un fenotipo bien definido para el estudio genético. Por ello, el estudio de fenotipos más recortados y mejor definidos puede ser de gran utilidad.
En el presente trabajo, se han seleccionado nueve genes de interés. Nuestra hipótesis principal es que variaciones en estos genes modulan la vulnerabilidad a padecer esquizofrenia o alguno de sus rasgos característicos, particularmente las alucinaciones auditivas, el deterioro cognitivo y la disfunción emocional. Como objetivo, nos planteamos el estudio de polimorfismos genéticos en varias muestras caso-control y familiares de España, Alemania y Estados Unidos. Se realizaron análisis de asociación caso-control, basados en familias y estudios de asociación con diferentes escalas clínicas. Asimismo, se estudió el impacto de ciertos polimorfismos sobre fenotipos de neuroimagen estructural y funcional. Los resultados más interesantes fueron los siguientes: por una parte, diferentes genes del sistema serotoninérgico (principalmente los genes SLC6A4 y HTR2A) parecían influir en el estado emocional del paciente, así como en la respuesta emocional del paciente a las alucinaciones auditivas. Además, el gen ASPM se asoció con el riesgo de psicosis y con diferentes parámetros cognitivos y de neuroimagen. Otros genes como NOS1, STMN1, PDE4D y PLEKHB1 parecían influir sobre el riesgo de psicosis, así como sobre las puntuaciones obtenidas en diferentes escalas psicopatológicas, si bien en estos casos la significación fue menor.
Todos estos resultados permiten proponer un modelo de vulnerabilidad, según el cual ciertos genes tendrían un mayor efecto sobre la vulnerabilidad a sufrir esquizofrenia, mientras que otros genes influirían sobre la severidad de ciertos síntomas. Además, nuestros resultados apoyan la existencia de una vulnerabilidad genética a respuestas emocionales aberrantes, que podría estar modulada por la variación en ciertos genes, tales como el transportador de serotonina.; Schizophrenia is a severe psychotic mental disorder, with a prevalence of around 1% in general population. It is well known that this disease presents a high heritability (around 80%). For this reason, there is a great interest in discovering the genetic factors affecting the risk for schizophrenia. However, due to the polygenic inheritance of this disorder, it is particularly hard to discover schizophrenia-related genes. Moreover, it has been hypothesized that an important number of environmental factors of different nature may affect the vulnerability to schizophrenia. Furthermore, schizophrenia is a clinically heterogeneous disorder and it can be particularly difficult to have a well-defined phenotype for genetic studies. For all these reasons, we consider that it is important to study the neurobiology of schizophrenia as a global entity, but also to complement these studies with other approaches, for example through the use of other alternative phenotypes, such as cognitive impairment, electrophysiological responses or auditory hallucinations, for example.
In the present study, different candidate genes were selected. Our main hypothesis is that variations in these nine genes modulate the vulnerability to schizophrenia and some of their most characteristic and important features, particularly auditory hallucinations, cognitive impairment and, finally, the emotional dysfunction associated to schizophrenia. To test this hypothesis, we focused the study on the analysis of genetic polymorphisms (mainly single nucleotide polymorphisms) in three case-control samples from Spain, Germany and United States and a family sample from the United States. All samples were of Caucasian origin. Different analysis were performed, namely case-control association analysis, family-based association analysis (in some cases) and association analysis with clinical measures that corresponded to different psychopathological scales (BPRS, KGV, PANSS and PSYRATS for auditory hallucinations and delusions). Moreover, we also assessed the impact of certain genetic polymorphisms on functional and structural neuroimaging phenotypes, which evaluated both cognitive and emotional aspects. The most interesting results were the following: first, several polymorphisms from serotonergic system genes (mainly SLC6A4 and HTR2A genes, but also TPH2 gene to a lesser extent) appeared to modulate the patient's emotional state, including the emotional response to auditory hallucinations, assessed with clinical scales and neuroimaging techniques. Moreover, the positive selection gene ASPM, involved in neurodevelopmental processes, was associated with the risk for psychosis and with different cognitive and neuroimaging measures in both the Spanish and the American sample. Other genes such as NOS1, STMN1, PDE4D and PLEKHB1 also appeared to influence the risk for psychosis and the scores in some psychopathological scales, although in these cases significance was weaker.
All these findings allow us to propose a vulnerability model. According to this model, some genes would have a major effect on the vulnerability to schizophrenia, while other genes would have an effect on the severity to certain symptoms. Regarding the vulnerability to auditory hallucinations, our results also support the existence of a genetic vulnerability to aberrant emotional responses, which could be modulated by the variation in different genes, such as the serotonin transporter gene, among others.

Estudio en Drosophila melanogaster del efecto de la reducción y la sobreexpresión de la proteína deficitaria en la ataxia de Friedreich

Tue, 12 Apr 2011 19:07:37 GMT

Estudio en Drosophila melanogaster del efecto de la reducción y la sobreexpresión de la proteína deficitaria en la ataxia de Friedreich Llorens Llorens, Jose Vte. La ataxia de Friedreich (FA) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva con una prevalencia en la población de 1- 4 casos cada 100.000 habitantes. La mutación más común que provoca la ataxia de Friedreich es la expansión de la repetición del microsatélite GAA situado en medio de una secuencia Alu-Sx en el primer intrón del gen FXN. Las repeticiones asociadas a la enfermedad se encuentran en el intervalo desde 70 a más de 1000 repeticiones del triplete. El gen produce una proteína llamada frataxina cuya síntesis se ve comprometida en los pacientes ya que las expansiones del triplete GAA interfieren en la transcripción del gen. La función de la proteína no está del todo clara aunque se conoce que desempeña dicha función en la mitocondria. Así, se barajan varias hipótesis, (1) la frataxina sería una proteína que participaría en el sistema de almacenaje del hierro en la mitocondria; (2) otra posible función que podría desempeñar la frataxina es que actuase como transportador de hierro; (3) como tercera posible función, la frataxina estimularía la actividad de la cadena de transporte de electrones activando la formación de ATP; (4) además se ha descrito que la frataxina actuaría como antioxidante mitocondrial, cuya función sería eliminar los productos oxidativos como son las especies reactivas del oxigeno (ROS); o por último (5) la frataxina actuaría como una proteína chaperona para la formación de los centros Fe-S de proteínas mitocondriales. En este trabajo se ha abordado el estudio de la función del gen fh en Drosophila melanogaster empleando la técnica del ARN de interferencia, así como la confirmación de la localización mitocondrial de la frataxina. El sistema de la ARN de interferencia fue complementado con el uso del sistema UAS-GAL4 que permite la interferencia del gen fh en un patrón concreto. En este caso se han realizado estudios a nivel bioquímico de individuos que interfieren el gen fh de forma ubicua. Además estos estudios se realizaron modificando las condiciones de estrés oxidativo. Los resultados obtenidos apoyan el hecho de que, al menos en nuestro modelo, este factor sería importante en el desarrollo de la enfermedad así como que, en estas condiciones de alto estrés oxidativo y con reducción de la proteína frataxina, la aconitasa sería la enzima más sensible. Por otra parte, se ha comparado el patrón de desarrollo embrionario de individuos que sobreexpresaban el gen fh y que expresan el gen humano FXN. Los tejidos que se han comparado son los más afectados en los pacientes con ataxia de Friedreich, y son el sistema nervioso periférico (SNP), el sistema muscular en el cual se incluye el corazón, así como también el sistema nervioso central (SNC). En este estudio hemos observado que se produce una falta de fusión entre algunos músculos del embrión de Drosophila melanogaster,. Además, se ha observado una gran desestructuración de las fibras nerviosas que forman SNP. Por otra parte, no se ha observado ningún defecto ni en el SNC, que concuerda con los resultados obtenidos con la sobreexpresión del propio gen fh, ni en el corazón, el cual sí se veía afectado en el desarrollo de los individuos que sobreexpresaban el gen fh. A nivel bioquímico, tanto la sobreexpresión del gen fh como la sobreexpresión del gen FXN tienen como resultado la reducción de la actividad de la enzima aconitasa. Estos resultados nos permiten afirmar que las funciones de la frataxina humana y la de Drosophila melanogaster están conservadas, apoyando el uso de este organismo como modelo tanto para el estudio de la función de la frataxina.; Friedreich ataxia (FA), the most common form of hereditary ataxia, is caused by a deficit in the mitochondrial protein frataxin. While several hypotheses have been suggested, frataxin function is not well understood. Oxidative stress has been suggested to play a role in the pathophysiology of FA, but this view has been recently questioned, and its link to frataxin is unclear. We report the use of RNA interference (RNAi) to suppress the Drosophila frataxin gene (fh) expression. This model system parallels the situation in FA patients, namely a moderate systemic reduction of frataxin levels compatible with normal embryonic development. Under these conditions, fh-RNAi flies showed a shortened life span, reduced climbing abilities, and enhanced sensitivity to oxidative stress. Under hyperoxia, fh-RNAi flies also showed a dramatic reduction of aconitase activity that seriously impairs the mitochondrial respiration while the activities of SDH, respiratory complex I and II, and indirectly complex III and IV are normal. Remarkably, frataxin overexpression also induced the oxidative-mediated inactivation of mitochondrial aconitase. This work demonstrates, the essential function of frataxin in protecting aconitase from oxidative stress-dependent inactivation in a multicellular organism. Moreover our data support an important role of oxidative stress in the progression of FA and suggest a tissue-dependent sensitivity to frataxin imbalance. We propose that in FA, the oxidative mediated inactivation of aconitase, which occurs normally during the aging process, is enhanced due to the lack of frataxin. Moreover we carried out studies comparing the development between flies overexpressing fh and flies overexpressing the frataxin human gene FXN. We have seen structural abnormalities in the muscular and nervous systems in flies interfering and overexpressing fh in an ubiquitous way or in a tissue-specific patterns (PNS and heart). Flies expressing human frataxin showed the same abnormalities in the PNS although these defects were stronger than those observed for fly frataxin overxpression. However the heart developed normally in the transgenic flies carrying the FXN gene. Concerning the biochemical studies, we have seen significant reduction of the aconitase activity being similar in all scenarios. Moreover, in all cases flies showed reduction of lifespan and defects in behaviour as climbing.

Estudio de factores genéticos de los sistemas relacionados con estrés oxidativo.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:36 GMT

Estudio de factores genéticos de los sistemas relacionados con estrés oxidativo. Mansego Talavera, Mª Luisa El riesgo de desarrollar una enfermedad cardiovascular en pacientes con hipertensión (HTA) se incrementa en más de 3 veces con respecto a otras enfermedades de elevado riesgo cardiovascular (diabetes, hipercolesterolemias, etc.), siendo además la HTA la mayor causa de mortalidad y morbilidad cardiovascular. La HTA se representa como una patología compleja que a menudo se asocia a otras alteraciones como microalbuminuria, disfunción endotelial, etc. Bajo estas condiciones fisiopatológicas se ha demostrado que se produce un aumento en la generación de especies oxidantes en el organismo, superando la capacidad de protección de los sistemas celulares de defensas antioxidantes, lo que provoca estrés oxidativo (EO).
En la presente tesis doctoral se ha caracterizado el EO a nivel bioquímico y genético, mediante el análisis de los productos finales de EO, niveles de ARN mensajero y polimorfismos de genes implicados en la producción y defensa de EO y que pudieran afectar a la presión arterial y el daño orgánico.
En este estudio se han analizado parámetros de EO como los glutatión reducido y oxidado, malondialdehido y 8-hidroxi 2-desoxiguanosina tanto en células mononucleares circulantes como en plasma de pacientes hipertensos (con y sin tratamientos) y en normotensos.
Además, se han cuantificado los niveles de ARNm de los principales genes de estos sistemas, en linfocitos de hipertensos y controles (NADPHoxidasa, catalasa, superóxidos dismutasas y enzimas del sistema glutatión y tiorredoxina).
Por otra parte, se ha realizado el estudio de variantes genéticas de genes de los sistemas implicados en EO, localizados en regiones que podrían afectar en la homeostasis oxidativa, lo que da lugar a alterarse la función de las proteínas y promotor región polimorfismos que alteran los niveles de EO como consecuencia de la regulación de genes. Esta parte del estudio se ha llevado a cabo en una población de hipertensos, controles y una población general.
Los resultados obtenidos nos muestran que en la HTA esencial:
1. Exite un aumento en los niveles de estrés oxidativo tanto en plasma como en células monolinfocitarias y a su vez este aumento se ve correlacionado con los niveles de presión arterial (PA) de los sujetos. Además, el EO se relaciona con el aumento los niveles de excreción urinaria de albúmina (EUA) independientemente de los valores de PA.
2. Se produce un aumento de los niveles de ARNm de genes que codifican las distintas subunidades de NAD(P)H oxidasa y una disminución de los niveles de ARNm de las enzimas antioxidantes en monolinfocitos. Además, estos cambios se relacionan con el estado crónico de EO presente en la HTA, a pesar de la activación del sistema tiorredoxina y la enzima Manganeso Superóxido Dismutasa. Por tanto, los pacientes hipertensos tanto en presencia o en ausencia de microalbuminuria se encuentran peor protegidos frente a EO que los sujetos control.
3. Independientemente del tratamiento antihipertensivo utilizado, los niveles de los marcadores bioquímicos de EO se reducen, y también los niveles de ARNm de todas las enzimas implicadas.
4. Los análisis de asociación han mostrado que ciertas variantes, y sus haplotipos, se encuentran asociadas a niveles de EO, PA, EUA y riesgo de microalbuminuria en sujetos hipertensos. Hay que destacar que estos datos se han replicado en otra población de hipertensos y en la población general, donde se han mantenido dos de estas asociaciones.
5. En el análisis de asociación entre los polimorfismos de distintos genes observamos la interacción entre el gen de la XDH y GPX1 en la población hipertensa. Estas interacciones nos confirman la naturaleza compleja de esta patología y de la necesidad de enfocar las nuevas investigaciones hacia el estudio de las interacciones entre distintos genes y estos con los factores ambientales.; Hypertension is a complex disease that is often associated with other disorders such as microalbuminuria, endothelial dysfunction, etc. Under this pathophysiological condition has been shown that there is an increase in the generation of oxidizing species in the body, without being able to avoid the protection capacity of cellular antioxidant defense systems, leading to oxidative stress (OS).
In this thesis OS status has been characterized by biochemical and genetic level of OS byproducts, messenger RNA levels and polymorphisms of oxidant and antioxidant system genes.
The results have shown increased levels of oxidative stress in blood and peripheral mononuclear cells and this increase is correlated with levels of blood pressure (BP) in essential hypertension.
Furthermore OS seems to be a determinant of urinary albumin excretion (UAE) independent of BP levels even in hypertensive subjects.
The increase in mRNA levels of genes encoding different subunits of NAD(P)H oxidase complex and decreased mRNA levels of antioxidant enzymes in peripheral mononuclear cells, has been related to the chronic state of OS in the hypertension, despite the action of thioredoxin system and manganese superoxide dismutase enzyme. Thus, hypertensive patients in presence or absence of microalbuminuria are less protected from OS compared to control subjects. Furthermore, any type of antihypertensive treatment reduced the levels of OS, and therefore also the mRNA levels of all enzymes involved.
The association analysis have confirmed that certain genetic variants, their haplotypes and their interactions, are associated with levels of OS, BP, UAE and microalbuminuria risk in hypertensive subjects. It should be noted that these results have been replicated in another hypertensive population and in spanish general population some associations have remained.

Genética de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth autosómica recesiva.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:36 GMT

Genética de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth autosómica recesiva. Claramunt Alonso, Reyes El objetivo de esta tesis doctoral es profundizar en el conocimiento de las bases genéticas y moleculares de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, especialmente de las formas con herencia autosómica recesiva. En este sentido, se incluyen los resultados obtenidos del análisis genético y molecular del gen GDAP1 en una serie de 118 familias de origen español, cuyas mutaciones son las causantes de la forma autosómica recesiva axonal tipo 4A (CMT4A), así como también, el estudio genético y molecular de la enfermedad de CMT en 17 familias españolas de etnia gitana con herencia autosómica recesiva y neuropatía desmielinizante.
Detectamos la presencia de seis mutaciones diferentes en el gen GDAP1 en 11 pacientes de nuestra serie de estudio, de las cuales tres habían sido descritas anteriormente (p.Q163X, p.S194X y p.T288fsX3) y caracterizamos tres nuevas mutaciones (p.E114fsX, p.R120W, p.T157P). Hasta el momento CMT4A había sido descrita como una forma clínica grave de CMT axonal con herencia autosómica recesiva, sin embargo en nuestra serie de estudio diferenciamos dos grupos: 1) pacientes portadores de 2 mutaciones y con un patrón de herencia recesivo, y 2) pacientes con una única mutación y con un posible patrón de herencia autosómico dominante, no descrito con anterioridad. Aportamos datos clínicos y electrofisiológicos que nos permitieron establecer una posible relación genotipo-fenotipo. El análisis de haplotipos de la mutación más frecuente en nuestra serie de estudio, p.Q163X, también encontrada en pacientes tejanos de origen hispanoamericano, nos permitió confirmar que dicha mutación tiene un origen ancestral común en la península ibérica, siendo su distribución y frecuencia actual consecuencia de un efecto fundador. En las 107 familias en las que no encontramos mutaciones en el gen GDAP1 excluimos al gen GDAP1L1 como responsable de la enfermedad de CMT en estos pacientes.
El análisis genético y molecular de la enfermedad de CMT en las 17 familias de etnia gitana se abordó en primer lugar, mediante el estudio de los loci conocidos asociados con la enfermedad de CMT en población gitana europea: la neuropatía sensitivo-motora hereditaria Lom (HMSN-Lom o CMT4D) y la neuropatía sensitivo-motora hereditaria Russe (HMSN-Russe o CMT4G), y en segundo lugar, la descripción de nuevos loci. Detectamos la mutación p. R148X en el gen NDRG1 en homocigosis como responsable de la neuropatía HMSN-Lom en un paciente de nuestra serie de estudio, y un posible ligamiento al locus HMSN-Russe en otras tres familias, aunque no pudimos confirmar dichos resultados al no estar descrito el gen. En las 13 familias restantes realizamos el análisis genético mediante el estudio de ligamiento y de haplotipos al locus CMT4C, debido a que la mayoría de nuestros pacientes presentaban un fenotipo clínico similar al locus CMT4C descrito en población no gitana. Encontramos en 13 de los 29 cromosomas estudiados la presencia de un haplotipo común mayoritario sugiriendo la existencia de una posible mutación ancestral común, mientras que en el resto de cromosomas se observaron variaciones alélicas respecto del haplotipo común que podía ser el resultado de recombinaciones ancestrales, o bien haplotipos diferentes. Estos resultados sugerían la posibilidad de la existencia de diferentes mutaciones o bien no se asociaban con mutaciones patológicas. Tras el análisis de mutaciones en el gen SH3TC2 caracterizamos dos nuevas mutaciones (p.R1109X y p.C737_P738delinsX) que no habían sido descritas en población no gitana como responsable de la enfermedad de CMT en 10 familias de nuestra serie de estudio. Detectamos, por tanto, que la causa más frecuente en nuestra serie de estudio de población gitana española fue la forma CMT4C y confirmamos la existencia de un único origen para la mutación p.R1109X, resultados que no fueron descritos con anterioridad en población gitana.; The aim of this doctoral thesis is to go in depth into the knowledge of the genetic and molecular inheritance. In this respect, we have included the results achieved from the genetic and molecular analysis of the GDAP1 gene in a series of 118 Spanish families by birth, which mutations are responsible for the axonal recessive form CMT4A, as well as the genetic and molecular study of 17 Spanish Gypsy families diagnosed with a demyelinating CMT disease compatible with an autosomal recessive trait.

We found mutations in nine isolated patients and two autosomal dominant families. Eight out of nine isolated patients were homozygotes or compound heterozygotes with autosomal recessive inheritance and one patient carried a de novo dominant mutation. Patients with homozygous or compound heterozygous genotypes showed a severe disease, whereas heterozygous patients from the two autosomal dominant families that segregated the p.R120W mutation showed a milder phenotype. We also report a de novo mutation, p.T157P, which has not been described. Haplotype analysis of the CMT4A locus confirmed a unique origin for the p.Q163X mutation 17 Spanish chromosomes and two Moroccan chromosomes carrying the p.S194X was also confirmed.

The molecular and genetic analysis of the CMT disease in the 17 Gypsy families was raised at first by means of the test of those known loci related with CMT disease in European Gypsy population: HMSN-Lom (MIM 601455) and HMSN-Russe (MIM 605285). Second, the description of new loci. We found the p.R148X mutation in the NDRG1 gene to be responsible for the HMSN-Lom neuropathy in one family and also possible linkage to the HMSN-Russe locus in three others. We have also studied the CMT4C locus because of the clinical similarities and showed that in 10 families, the disease is caused by mutations located on the SH3TC2 gene: p.R1109X in 20 of 21 chromosomes and p.C737_P738 in only one chromosome. Moreover, the SH3TC2 p.R1109X is associated with a conserved haplotype and, therefore, may be private founder mutation for the Gypsy population.

Diversidad genética en las especies del complejo Saccharomyces sensu stricto de fermentaciones tradicionales.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:35 GMT

Diversidad genética en las especies del complejo Saccharomyces sensu stricto de fermentaciones tradicionales. Arias García, José Armando El género Saccharomyces incluye tanto especies naturales como especies de levaduras que se utilizan en fermentaciones industriales y tradicionales. Algunas bebidas fermentadas, como son el Pulque y la Chicha, se obtienen mediante un proceso tradicional desarrollado durante el Neolítico americano en las civilizaciones precolombinas mesoamericanas y andinas. Por ello, las levaduras que participan en estos procesos de fermentación han estado aisladas de las poblaciones vínicas del resto del mundo, hasta la llegada de los europeos en 1942, con la introducción de nuevos procesos fermentativos, como son la producción de vino y los destilados. El objetivo del presente estudio fue determinar la variación genética de las cepas del género Saccharomyces, tanto presentes en fermentaciones tradicionales como las de procesos fermentativos industriales, para deducir el origen y la historia evolutiva de Saccharomyces cerevisiae. Con técnicas moleculares se detectó a S. cerevisiae y S. paradoxus en bebidas tradicionales de Latinoamérica, y mediante estudios fisiológicos se demostró que S. cerevisiae presenta propiedades tecnológicas adecuadas para una fermentación vínica. Con el análisis filogenético de cuatro regiones nucleares y una mitocondrial se detectó que S. cerevisiae esta compuesta por dos poblaciones, una de ambientes vínicos y la otra de ambientes no vínicos, muy diferentes entre ellas. Las poblaciones vínicas se caracterizan por ser un grupo muy homogéneo, con baja tasa de recombinación, alta frecuencia de homocigosis, con menos diversidad genotípica y menos divergencia nucleotídica. Esto indica una reciente domesticación, con reproducción clonal y sucesos de autodiploidización. En cambio, las poblaciones no vínicas están formadas por un grupo muy heterogéneo, con reproducción clonal pero la reproducción sexual más frecuente por anfimixis. La detección de alelos vínicos y no vínicos entre las cepas de las poblaciones latinoamericanas indica que existe flujo genético entre ambas poblaciones. Por otro lado, se detectó que los alelos vínicos de S. cerevisiae no provienen de S. paradoxus sino de los alelos no vínicos de S. cerevisiae. En base a los resultados obtenidos se proponen dos posibles escenarios no incompatibles para el origen de S. cerevisiae. En un primer escenario, las cepas no vínicas forman una población muy heterogénea con alelos muy diversos, lo que dio lugar a la aparición de las cepas vínicas por domesticación, y se vio reducida la diversidad genética cuando se fijaron los alelos vínicos. En el segundo caso, las cepas vínicas y no vínicas, son poblaciones con alelos muy diferentes, pero con flujo genético se intercambiaron alelos vínicos en no vínicos, pero muy raro en el otro sentido. Finalmente se proponen que al menos tres eventos de hibridación dieron origen a las cepas híbridas aisladas de vinos, y probablemente a partir de uno solo para las cepas híbridas cerveceras. Sin embargo, los fenómenos de recombinación y de introgresión detectados entre diferentes especies de Saccharomyces permiten suponer que la hibridación puede ocurrir con mayor frecuencia.; Traditional fermented beverages and foods from Latin America are poorly studied. The yeast microbiota involved in these ancient processes has been isolated from "Old World" yeast populations until the introduction of winemaking and distillation. The aim of this work was to study the genetic variation of Saccharomyces strains from traditional and industrial fermentations and to deduce the origin and evolution of S. cerevisiae. S. cerevisiae and S. paradoxus were isolated from traditional Latin American fermentations. Some of the investigated S. cerevisiae strains showed good physiological properties that are important in the wine production. A genetic analysis was performed based on sequencing of four nuclear and one mitochondrial gene of strains isolated from Latin-American traditional and industrial (mainly European) fermentative processes. Genetic variability from S. cerevisiae strains shows two populations, one from wine and the second from non-wine fermentations. Wine population represent a very homogeneous group, with low recombination rate, high frequency of homozygous strains, low genotypic diversity and low nucleotide divergence. These finding indicate a recent domestication event by clonal reproduction and some events of haplo-selfing. Non-wine populations represent a heterogeneous group, with clonal reproduction and rare sexual reproduction by anfimixis. Wine and non-wine alleles detected in Latin-American populations indicated genetic flow. Phylogenetic analysis shows that wine alleles of S. cerevisiae are originated from non-wine alleles of S. cerevisiae, but not from S. paradoxus. Two theories are proposed for the origin of wine S. cerevisiae strains: 1) wine yeast represent a population with low genetic diversity because "wine" alleles were fixed and emerged after domestication event from an ancestral and heterogeneous population of non-wine yeast; 2) wine and non-wine strains represent populations with different alleles, but genetic flow is frequent from wine to non-wine, and rare in opposite direction. Recombination and introgresion events detected in Saccharomyces species indicated that hybridizations occur more frequently then expected. According to the phylogenetic results wine hybrids S. cerevisiae x S. kudriavzevii were originated from three hybridizations events, and brewery hybrids from one.

Terapía génica antitumoral mediante vacunas con células modificadas genéticamente.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:34 GMT

Terapía génica antitumoral mediante vacunas con células modificadas genéticamente. Herrero Cervera, María José Una de las estrategias más satisafactorias empleadas en la lucha contra el cáncer es la utilización de la terapia génica para actuar en la inmunomodulación, es decir la actuación sobre el propio sistema inmunitario del paciente para que sea éste quien reconozca al tumor como algo foráneo, que no escape a la inmunovigilancia y lograr destruirlo. En esta tesis doctoral hemos explorado bajo este concepto las vacunas por terapia génica no viral, tanto preventivas como terapéuticas, trabajando bien con antígenos aislados y genes como con células y genes. Los experimentos en modelo de melanoma murino, se han divido en tres grandes bloques. 1) En las vacunas preventivas con antígenos, se obtuvieron diferentes tasas de reducción de volumen tumoral, acompañadas de producción de inmunnoglobulinas G específicas frente al tumor tratado. Se obtuvieron los mejores resultados en modelos de vacunación con acondicionamiento tisular en los que inicialmente se acondicionaba al animal con los antígenos purificados, transfectando posteriormente con plásmidos desnudos productores del gen de mGM-CSF. 2) En las vacunas preventivas celulares, transfectando células B16 con plásmidos portadores de los genes de mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 y combinaciones entre ellos, se obtuvo la protección total frente al tumor en los animales vacunados con 3 dosis de 2x105 células transfectdas, irradiadas, no seleccionadas. Además se demostró que la vacunación había generado memoria inmunológica, al repetir la exposición al tumor en los mismos animales un año después y volver a lograr la protección total. Adicionalmente se realizaron experimentos de vacunación exclusivamente con las células transfectadas, seleccionadas y purificadas mediante bolas magnéticas. 3) Por último, se realizaron experimentos de vacunación terapéutica, en animales portadores de tumor, siguiendo el modelo de células transfectadas. Se probaron diferentes dosis celulares y el tratamiento previo con ciclofosfamida. Los mejores resultados de inhibición tumoral y prolongación de la supervivencia se obtuvieron en las vacunas con 2 millones de células/dosis. Finalmente se realizó una primera aproximación al estudio del bloqueo del éxito de la vacunación terapéutica, analizando la población de células T reguladoras en los animales tratados.; One of the most satisfactory strategies against cancer is the use of gene therapy for immunemodulation, that is acting over the patient's immune system in order to make it recognize the tumor and fight properly against it. In this thesis, we have explored the nonviral gene therpy vaccines under this concept, working with preventive as well as therapeutic models, with purified antigens and genes and also with whole cells and genes. The experiments have been performed with a murine melanoma model and been divided in three sets. 1) In preventive antigen vaccines, different rates of tumor growth inhibition were obtained, acompained by specific antitumor immunoglobulin G production. The best results were obtained with tissue conditioning, where the animals were firstly conditioned with purified tumor antigens and later the tissues were transfected in vivo with naked plasmids producing mGM-CSF. 2) In preventive cell vaccines, transfecting B16 cells with plasmids bearing mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 genes alone or combined, total tumor protection was obtained vaccinating with 3 doses of 2x105 transfected, irradiated, non selected cells. This vaccine also showed immunological memory since a second challenge to the tumor in the same animals one year later also reached total protection. In addition, experiments vaccinating only with the selected population of transfected cells, by means of magnetic beads, were performed. 3) Finally, therapeutic vaccines were evaluated, continuing with transfected cells. Different cell doses and pretreatment with cyclophosphamide were tested. The best results of tumor growth inhibition and survival were obtained with 2 million transfected cells/dose. A first approach to the study of the blockade in therapeutic model success was performed analysing the regulatory T cell population in the treated animals.

Caracterización de Septin 4, un gen que codifica un potencial sustrato de Parkin en Drosophila.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:33 GMT

Caracterización de Septin 4, un gen que codifica un potencial sustrato de Parkin en Drosophila. Muñoz i Soriano, Verònica

Aspectos analíticos y epidemiológicos de la infección por virus de la Hepatitis C con donantes de sangre de la Comunidad Valenciana entre 1990 y 2002.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:32 GMT

Aspectos analíticos y epidemiológicos de la infección por virus de la Hepatitis C con donantes de sangre de la Comunidad Valenciana entre 1990 y 2002. Vila Romero, Enrique En el periodo 1991-2002 la prevalencia de infección por virus de la hepatitis C (VHC) en la población de donantes de sangre de la Comunitat Valenciana ha disminuido un 66%, estando en el último año (2002) alrededor del 0.27%. En general, la prevalencia en nuestra Comunidad fue superior a la media de España y a la de otros países europeos y similar a la de Estados Unidos y Japón.
En cuanto a la tasa de incidencia de la infección por VHC en donantes de sangre, la Comunitat Valenciana ha disminuido en el periodo de estudio casi 30 veces, llegando a un valor de 3.4 x 105 donante-años en 2002, presentando una tasa superior a la del resto de España y de los demás países considerados. Por tanto, el riesgo residual ha disminuido también en este periodo, llegando a ser de 1.12 x 106 donaciones en 2002. Este valor también ha sido superior respecto a los demás países comparados.
Entre las distintas provincias de la Comunitat Valenciana hay diferencias significativas entre los valores de prevalencia anual, siendo en el periodo 1991-1999 mayores en las provincias de Valencia y Castellón que en la provincia de Alicante (p<0.05). En cambio, en el periodo 2000-2002 los valores de prevalencia de VHC en Alicante han sido similares a los de las provincias de Valencia y Castellón.
A lo largo del periodo 1990-2002, han ido disminuyendo los valores de prevalencia, incidencia y riesgo residual de transmisión de VHC. La disminución del riesgo residual se ha producido en parte por el aumento de sensibilidad en las pruebas de cribado. La exclusión de los donantes con riesgo de transmitir el VHC y la información recibida por la población general sobre las vías de contagio de la infección han contribuido, probablemente, al descenso de la prevalencia e incidencia.
En cuanto a las técnicas clásicas de detección de anticuerpos empleadas en el estudio, la especificidad de las pruebas serológicas de cribado de 3ª generación para la detección de anticuerpos anti-VHC (99.84%) ha sido mayor que la de las pruebas de 2ª generación (p<0.05). Respecto a las pruebas serológicas de confirmación, la proporción de resultados indeterminados obtenidos con las pruebas de 2ª y 3ª generación ha sido similar (25-30%).
La introducción de la pruebas amplificación genómica (NAT) en 1999 para el cribado de todas las donaciones de sangre en la Comunitat Valenciana no ha supuesto grandes dificultades y ha reducido el periodo ventana de la infección por VHC y, por tanto, el riesgo residual. El rendimiento observado con la introducción de las pruebas de detección genómica del VHC en la Comunitat Valenciana, entre 1999 y 2006 ha sido de una donación en periodo de ventana serológico por cada 320000 unidades de sangre. Este rendimiento es superior al obtenido en otros centros de transfusión españoles, europeos y de Estados Unidos, lo cual podría deberse a la prevalencia de infección por VHC más elevada en nuestra comunidad. El rendimiento esperado por la introducción de dichas pruebas NAT en el periodo 2000-2002 ha resultado ser similar al rendimiento NAT observado.
La puesta en marcha de la prueba NAT en el cribado de donaciones de sangre, ha hecho que sea innecesaria la prueba de cuantificación de la enzima alanina aminotransferasa (ALT) para la detección de infección por VHC en las fases iniciales de la enfermedad.; In the period 1991-2002 the prevalence for HCV infection in the population of blood donors of the Valencian Region has dropped 66%, being in the last year (2002) around 0.27%.
As the incidence rate of the infection for HCV in the Valencian blood donors has been reduced in the period of study 30 times, reaching 3.4x105 donor-years in 2002, the residual risk has also dropped in this period, being of 1.12x106 donations in 2002.
Among the different provinces of the Valencian Region there are significant differences on annual prevalence, being the provinces of Valencia and Castellón higher than the province of Alicante (p<0.05) in the period 1991-1999. On the other hand, in the period 2000-2002 the prevalence of HCV in the three provinces have been similar.
Along the period 1990-2002, the prevalence, incidence and residual risk of transmission of HCV have continued dropping. The decrease of the residual risk has taken place partly due to the increase of sensibility in the screening tests. The exclusion of the donors with risk of transmitting the HCV infection and the public awareness of infection has probably contributed to the descent of the prevalence and incidence rates.
As regards the antibodies detection test used in the study, the specificity of screening serologic test of third generation (99.84%) for detection of the Hepatitis C Virus (HCV) has been higher than that of second generation test (p<0.05). About the confirmation serologic test, the proportion of indeterminate results obtained with the second and third generation test has been similar (25-30%).
The introduction screening genomic test (NAT) in our center has not been difficult, the window period of the infection for HCV has been reduced and thus, the residual risk. Between 1999 and 2006, the observed yield with the introduction of the genomic test for detection of the HCV in the Valencian Region, has been 1:320000. This observed yield has been similar to the expected yield by NAT test between 2000 and 2002.
Due to the implementation of the NAT screening test in blood donations, the alanine aminotransferase (ALT) quantification test for the detection of HCV in the initial phases of the illness is unneccessary.

Caracterización molecular de los receptores de gonadotrofinas de lubina (Dicentrarchus labrax)

Tue, 12 Apr 2011 19:07:32 GMT

Caracterización molecular de los receptores de gonadotrofinas de lubina (Dicentrarchus labrax) dos Santos Rocha, Ana María En los vertebrados, las gonadotrofinas (FSH y LH) son hormonas esenciales en el control de la gametogénesis y esteroidogénesis gonadal. Sus acciones están mediadas por la activación de sus respectivos receptores. A pesar de su importancia en la función reproductora, en teleósteos se dispone de muy poca información relativa a estos receptores. En este trabajo se investigaron las características moleculares, estructurales y funcionales de los receptores de gonadotrofinas (FSHR y LHR) de un teleósteo marino, la lubina (Dicentrarchus labrax). Además, se evaluó la especificidad de unión al ligando de estos receptores. Usando un método de RT-PCR cuantitativo, se midieron los perfiles de expresión de los receptores de gonadotrofinas durante la primera maduración gonadal de machos y hembras de lubina. Asimismo, se investigaron posibles relaciones entre estos perfiles, los de la proteína responsable de la respuesta aguda de la esteroidogénesis (StAR) y los perfiles plasmáticos de esteroides sexuales. Estudios recientes realizados en diversas especies de peces sugieren que el receptor de TSH (TSHR), que comparte características estructurales con los receptores de gonadotrofinas, podría estar directamente implicado en la fisiología gonadal. Por ese motivo, en este trabajo se investigó una posible participación del TSHR en la función reproductora de la lubina.

Los resultados obtenidos contribuyen a entender en que momento del ciclo reproductor las células germinales en crecimiento son sensibles a las señales procedentes de la hipófisis (gonadotrofinas). Además, se ha demostrado que, a diferencia de otros peces, las interacciones entre los receptores de gonadotrofinas de lubina y sus respectivos ligandos son específicas. Asimismo, podemos decir que en la lubina, los receptores de gonadotrofinas se expresan en momentos diferentes del ciclo reproductor. Esto apoya la idea de que la FSH y la LH poseen diferentes acciones en el control de la función gonadal. Desde de un punto de vista aplicado, estos conocimientos podrían ser de gran importancia en la manipulación del ciclo reproductor de esta especie de gran valor económico. Por lo tanto, estos estudios son relevantes tanto por su componente de investigación básica como por las posibles aplicaciones que pueden derivarse.; In vertebrates, the pituitary gonadotropins, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), are the main regulators of gametogenesis and gonadal hormone production. To exert their biological actions, gonadotropins must bind to, and activate specific cell-surface receptors. The primary aim of the studies underlying this thesis was to investigate the role of gonadotropins in the sea bass (Dicentrarchus labrax) reproductive function by studying their cognate receptors.

Two cDNAs encoding a FSH receptor (sbsFSHR) and a LH receptor (sbsLHR) were cloned and characterized. Their gene structure, expression, and functional activity were evaluated. Sea bass FSHR and LHR mature proteins display typical features of the glycoprotein hormone receptor family members, but the sbsFSHR also contains some remarkable differences when compared with other fish or mammalian FSHRs. Among them, a distinct extracellular N-terminal cysteine domain as regards to its length and cysteine number, and the presence of an extra leucine-rich repeat. sbsLHR is more conserved than sbsFSHR when comparing their genomic primary structures with other vertebrate gonadotropin receptors, particularly in the extracellular domain. Furthermore, two alternately spliced variants of the sbsFSHR were amplified. Both correspond to transcripts originated by removal of exons from the extracellular domain. Expression analysis revealed that the sbsFSHR is exclusively expressed in gonads, specifically in the wall of previtelogenic and early-vitelogenic follicles. On the contrary, sbsLHR mRNA was found to be widely distributed in somatic tissues.

Recombinant sbsFSHR was specifically stimulated by bovine FSH, while sbsLHR was activated by both bovine LH and FSH. Nevertheless, specific stimulation of both sea bass FSHR and LHR was observed when recombinant sea bass gonadotropins were used advancing specific interactions. This behaviour differs from studies in other teleost where promiscuous activation was reported.

The expression profiles of sea bass gonadotropin receptors were investigated in the gonads of both sexes during a complete reproductive cycle, in parallel with the expression of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) gene and reproductive hormones. While in male sea bass, both gonadotropin receptors show different expression patterns, in females their expression patterns were somehow similar. Expression of the sbsFSHR was connected with early stages of gonadal development, but also with the spermiation period in males and the maturation-ovulation period in female. The expression profile of the sbsLHR, in both sexes, supports the already suggested involvement of LH in the regulation of the final stages of fish gamete maturation and ovulation/spermiation. sbsStAR expression was strongly correlated with sbsLHR expression. In addition, the expression profile obtained for sbsStAR suggests that this protein mediates the rapid delivery of sterol substrate for the synthesis of gonadal maturation inducing steroids. No strong relationship between gonadotropin receptor expression and plasma levels of the analysed sex steroids was seen. Further studies will be needed to understand how gonadotropins and sex steroids interact to regulate sea bass reproduction.

Recent studies reported abundant expression of TSHR transcripts in both the ovary and testis of some fish species. To help elucidate the physiological role that TSHR may have in the gonadal function of sea bass, a cDNA encoding a TSHR was isolated from the gonads of this fish species. The mature protein displays typical features of the members of the glycoprotein hormone receptor family. By RT-PCR analysis we demonstrate the extra-thyroidal expression of sbsTSHR in numerous tissues of the sea bass. Seasonal changes in sbsTSHR mRNA levels in female and male sea bass during puberty suggest that in females the TSHR could participate in active vitellogenesis and in the regulation of gamete maturation and ovulation, whereas in males, the TSHR would be involved in the regulation of early stages of the gonadal development and also of gamete maturation and spermiation.

Replicación de los viroides nucleares: motivos estructurales y enzimas implicados en el procesamiento in vivo de sus intermediarios oligoméricos.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:31 GMT

Replicación de los viroides nucleares: motivos estructurales y enzimas implicados en el procesamiento in vivo de sus intermediarios oligoméricos. Gas López, Mª Eugenia Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y su función.
La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son controvertidos.
En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis del extremo 5' de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en RNAs oligoméricos.
El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una aplicación más restringida.
Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan RNAs monoméricos lineales con extremos 3' con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5'-P, 3'-OH compatibles con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única caracterizada en plantas.; Viroids are small, circular, noncoding RNAs that currently are known to infect only plants. They also are the smallest self-replicating genetic units known. Without encoding proteins
and requirement for helper viruses, these small RNAs contain all the information necessary to mediate intracellular trafficking and localization, replication, systemic trafficking, and pathogenicity. All or most of these functions likely result from direct interactions between distinct viroid RNA structural motifs and cellular factors. Viroids present a simple model system to address some basic questions about the RNA structure-function relationships.
Replication of viroids entails reiterative transcription of their incoming single-stranded circular genomes, to which the (+) polarity is arbitrarily assigned, cleavage of the oligomeric strands of one or both polarities to unit-length, and ligation to circular RNAs. While cleavage in chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) is mediated by hammerhead ribozymes, where and how cleavage of oligomeric (+) RNAs of nuclear viroids (family Pospiviroidae) occurs in vivo remains controversial.
In the present work we have re-examined this question in vivo, using transgenic Arabidopsis lines expressing three dimeric nuclear viroid RNAs and host plants infected. Using this methodology, we have mapped the processing site of these three members at equivalent positions of a conserved region (the hairpin I/double-stranded structure that the upper strand and flanking nucleotides of the central conserved region can form). Together with mapping the in vivo processing site, our results with sixteen mutants of one of these viroids support that cleavage is directed by an RNA motif conserved in all members of the family, and ligation by an extended conformation containing a motif termed loop E. These results have deep implications on the underlying mechanism of both processing reactions, which are most likely catalyzed by enzymes different from those generally assumed: cleavage by a member of the RNase III family, and ligation by an RNA ligase distinct from the only one characterized so far in plants, thus predicting the existence of a least a second plant RNA ligase.

Fisiología de la reproducción del lenguado senegalés (Solea senegalensis): mecanismos endocrinos y aplicaciones en acuicultura.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:30 GMT

Fisiología de la reproducción del lenguado senegalés (Solea senegalensis): mecanismos endocrinos y aplicaciones en acuicultura. Agulleiro i Gozalbo, Maria Josep En el presente trabajo investigamos algunos de los mecanismos endocrinos implicados en el crecimiento oocitario del lenguado senegalés (Solea senegalensis), así como el desarrollo de métodos para el control de su reproducción en cautividad. La tesis se dividió en tres partes diferentes:
(i) Capítulo 1: Introducción General donde se resume el estado actual de conocimientos sobre los mecanismos endocrinos implicados en la reproducción de teleósteos, y se introduce al lector en los beneficios y problemas actuales de la acuicultura de peces planos, especialmente del lenguado senegalés (Solea senegalensis);
(ii) Capítulos 2 y 3, donde se investiga el proceso de vitelogénesis en el lenguado senegalés. En el Capítulo 2, se caracteriza el ADN complementario de ambas isoformas del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad/vitelogenina (Vtg), vtgr, y de una nueva proteína de unión a ácidos grasos (FABP), FABP11, encontrada exclusivamente en peces teleósteos. El análisis de expresión de estos genes en ovario de lenguado senegalés, sugiere que el nivel de los transcritos de vtgr puede ser utilizado como marcador molecular para determinar el número de oocitos reclutados en vitelogénesis, mientras que los niveles de expresión de fabp11 pueden funcionar como un marcador molecular muy útil para determinar los procesos celulares y factores ambientales que regulan el proceso de la atresia folicular. En el Capítulo 3, se valida un ELISA homologo para determinar la concentración de Vtg en plasma. Mediante este análisis se correlacionan las variaciones anuales de Vtg con los niveles de 17-estradiol, índice gonadosomático y porcentaje de oocitos en diferente estadio de desarrollo oocitario; y
(iii) Capítulos 4 y 5, donde se investiga la aplicación de diferentes métodos hormonales para inducir a la ovulación y a la espermiación en lenguado senegalés en condiciones de cautividad. En el Capítulo 4, se tratan machos y hembras con un agonista de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHa), tanto mediante inyecciones sucesivas como mediante implantes de liberación sostenida. El tratamiento con GnRHa resulta eficaz para inducir la ovulación y la puesta en hembras F1 incapaces de reproducirse en cautividad. En cambio, el mismo tratamiento con GnRHa en machos es aparentemente ineficaz para aumentar la producción de esperma y/o estimular la espermatogénesis. En el Capítulo 5, el tratamiento de machos adultos con GnRHa en combinación con 11-ketoandrostenediona (OA), precursor de 11-ketotestosterona (11-KT), acelera la espermatogénesis y aumenta los niveles plasmáticos de los metabolitos 5β-reducidos de 17α,20β-dihidroxi-4-pregnan-3-ona (17,20βP), esteroide implicado en la maduración del esperma en salmónidos. Además, la motilidad del esperma producido por los machos tratados con GnRHa+OA, se ve duplicada respecto al esperma producido por el grupo control o el grupo tratado sólo con GnRHa. Por tanto, el tratamiento de machos de lenguado senegalés con GnRHa+OA puede ser empleado como potencial terapia hormonal para mejorar disfunciones reproductivas de machos de lenguado senegalés en condiciones de cautividad.

En resumen, la presente tesis ha contribuido a profundizar en el conocimiento de los mecanismos endocrinos implicados en la gametogénesis del lenguado senegalés, y ha establecido algunos protocolos para la inducción de la ovulación y la espermiogénesis a través de terapias hormonales en esta especie de elevado interés comercial.; The present work was aimed at the investigation of some endocrine mechanisms involved in oocyte growth in the Senegalese sole (Solea senegalensis), as well as to develop methods for the control of reproduction of this species in captivity. The thesis was divided into three separate parts:
(i) Chapter 1, a General Introduction where it was reviewed the endocrine regulation of reproduction in teleosts, and it introduced the reader into the significance and current problems in the culture of flatfish, particularly the Senegalese sole;
(ii) Chapters 2 and 3, in which it was investigated the vitellogenic process of Senegalese sole. In chapter 2, it is described the isolation of complementary DNAs encoding two isoforms of very low-density lipoprotein/vitellogenin receptor (VtgR) and a novel fatty acid-binding protein (FABP), FAB11. The analysis of expression of these genes suggested that the the level of vtgr transcripts in the ovary may be used as a functional marker to quantify the number of oocytes recruited for vitellogenesis, while that of fabp11 may be a very useful molecular marker for determining cellular events and environmental factors that regulate follicular atresia. In chapter 3, an homologous EIA to quantify plasma vitellogenin was developed, and annual plasma levels of vitellogenin were correlated with changes in plasma 17-estradiol, gonadosomatic index, and percentage of oocyte at different developmental stage in the ovary; and
(iii) Chapters 4 and 5, in which it was investigated the induction of ovulation and spermiation in Senegalese sole. In chapter 4, males and females were treated with gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa). Treatment was able to induce ovulation and spawning of F1 females that often fail to reproduce. However, this treatment was ineffective in males. Further studies were performed in chapter 5, where GnRHa treatment in combination with a biosynthetic precursor of 11-ketotestosterone, stimulated spermatogenesis, increasing the production of conjugated forms of 17,20-dihydroxy-4-pregnen-3-one, enhancing the motility of spermatozoa by 2-fold.

In conclusion, the present work has contributed with novel information on the endocrine mechanisms involved in gametogenesis in Senegalese sole, and has established some protocols for the induction of ovulation and spermiation in this species through hormonal therapies.

Análisis de la función molecular de las proteínas Muscleblind de Drosophila.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:30 GMT

Análisis de la función molecular de las proteínas Muscleblind de Drosophila. Vicente Crespo, Marta El gen muscleblind (mbl) es necesario para el adecuado desarrollo del sistema nervioso periférico embrionario y la diferenciación terminal de los fotorreceptores y los músculos en Drosophila. A partir del único gen muscleblind de Drosophila se generan cuatro transcritos por procesado alternativo que codifican para cuatro proteínas caracterizadas por la presencia de dedos de zinc del tipo Cys3H. Los homólogos de muscleblind en vertebrados son los genes Muscleblind-like1, 2 y 3 (MBNL1-3). Las proteínas humanas MBNL1, 2 y 3 tienen la capacidad de modificar el procesado alternativo de diversos transcritos y tienen un papel importante en la patogénesis de la distrofia miotónica (DM). La DM es una enfermedad autonómica dominante generada por la expansión del trinucleótido CTG en una región no codificante del gen DMPK. La presente tesis recoge experimentos realizados en diferentes sistemas para desvelar la función molecular de las proteínas Muscleblind de Drosophila. Este trabajo demuestra la conservación de la actividad como factores de splicing alternativo y la ruta patogénica de la DM en moscas. Se describen dos nuevas dianas moleculares de las proteínas Muscleblind, los transcritos de la alpha-actinina y la troponinaT, cuyo patrón de splicing está alterado en mutantes mbl y en moscas que expresan repeticiones CUG. Además, mediante experimentos en cultivo celular se muestra la capacidad de estas proteínas de inducir muerte celular al ser sobre-expresadas en células S2 de Drosophila. Las isoformas de Muscleblind mostraron diferente capacidad en los distintos ensayos funcionales realizados. Mediante experimentos de sobre-expresión en células de vertebrado y mutagénesis dirigida mostramos la implicación de los extremos carboxilo en la diversificación funcional de las isoformas de Muscleblind. Las isoformas se localizan en distintos compartimentos sub-celulares y la eliminación de un sitio putativo de sumolización (FKRP) conservado altera la capacidad de inducir muerte celular de MuscleblindC.; The human Muscleblind-like proteins MBNL1-3 bind RNAs through pairs of zinc fingers of the Cys3His type. They have the ability to modify alternative splicing and sub-cellular localisation of defined transcripts and their function is impaired in myotonic dystrophies type 1 and 2 (DM1 and DM2). DMs are autosomal dominant neuromuscular diseases characterized by myotonia, muscle weakness, and iridescent cataracts, among other symptoms. At a molecular level, DM patients show disruption of alternative splicing regulation of specific transcripts. The genetic cause of these diseases is the expansion of either a CTG or a CCTG repeat in non-coding regions of the DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. Upon transcription, expanded RNAs form stable hairpins, which sequester nuclear factors depleting them from their normal function. Among those factors are the MBNL proteins. The relevance of MBNL sequestration in DM pathogenesis is supported by muscleblind like 1 knock-out mice (Mbnl1DE3/DE3), which reproduce the main features of DM patients including myotonia, cataracts, and RNA splicing defects in transcripts such as troponinT 2 and 3. Furthermore, expression of Mbnl1 protein reverts the DM-like alterations of mice expressing expanded CUG containing RNA.

Obtención y caracterización de mutantes funcionales del gen frataxin homologue (FH) en Drosophila.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:29 GMT

Obtención y caracterización de mutantes funcionales del gen frataxin homologue (FH) en Drosophila. Navarro Langa, Juan Antonio La ataxia de Friedreich es una enfermedad humana neurodegenerativa y de herencia
autonómica recesiva. Es la ataxia hereditaria más común en la población caucásica. La
enfermedad está causada por la deficiencia de la proteína frataxina. Las claves sobre la
función de la frataxina provienen de los diferentes estudios llevados a cabo en varios
organismos modelo. Se han aislado los genes ortólogos en un número elevado de
organismos desde bacterias al ratón y también en plantas. En nuestro laboratorio se ha
aislado el gen de Drosophila que codifica para la proteína frataxina, el gen fh.
Drosophila ha resultado ser un excelente modelo para el estudio de enfermedades
humanas dado que son muchos los procesos biológicos conservados entre la mosca y el
hombre, como por ejemplo, la formación y degeneración del sistema nervioso, la
generación y función del corazón, el metabolismo mitocondrial, etc.En este trabajo se
ha abordado el estudio de la función del gen fh en D. melanogaster empleando tres de
las múltiples estrategias existentes en este organismo orientadas a la obtención de
fenotipos mutantes: la movilización de elementos transponibles P, el sistema ARNi y la
sobreexpresión. Con los experimentos de mutagénesis insercional no se obtuvieron los
resultados esperados debido a que el gen fh es un gen pequeño localizado en una región
rica en genes y flanqueado por dos e incluso tres puntos calientes de inserción. Se
abordó entonces una segunda aproximación consistente en el uso del sistema UASGAL4
para el desarrollo de experimentos de sobreexpresión e interferencia. La
interferencia o la sobreexpresión del gen fh en los tejidos de Drosophila equivalentes a
aquellos afectados en los pacientes (sistema nervioso periférico, músculo y corazón) y
en el desarrollo embrionario de Drosophila, inducen la aparición de letalidad, de alguna
alteración fenotípica o de alguna modificación del comportamiento. Los defectos
encontrados se concentran por una parte en el SNP, tanto en las neuronas y axones del
comportamiento sensorial, como en los axones motores embrionarios. En esta caso las
neuronas motoras no parecen afectadas, aunque la sobreexpresión y la intereferencia en
estas estructuras si que han inducido defectos en el adulto. Por otra parte, se han
observado alteraciones importantes en varios de los derivados del mesodermo
embrionario, como son el músculo somático y las células cardiacas y pericardiacas.
Todos estos defectos conducen a la aparición de 100% de letalidad antes de la emersión
del adulto o a una disminución de la capacidad de supervivencia y escalada en los casos
en los que se obtiene descendencia. La interferencia y la sobreexpresión en el músculo
sólo han resultado efectivas si la alteración se produce en los primeros momentos del
desarrollo de las estructuras afectadas. Por su parte, en el SNP sólo se han producido
daños cuando se han afectado conjuntos de precursores sensoriales o de neuronas
sensoriales recién diferenciadas, que participan en la formación de los órganos
sensoriales en el embrión y en el adulto. Pero al parecer, la función de fh no es igual de
importante en todos los órganos sensoriales, ya que la modificación de su expresión en
los órganos cordotonales no parece producir ningún efecto significativo, aunque es
posible que sea debido a que las funciones que desarrollan también son realizadas por
las neuronas multidendríticas.
Todos los resultados descritos permiten establecer un modelo, en D. melanogaster, para
el estudio de la ataxia de Friedreich.; Friedreich ataxia is a severe autosomal recessive disease characterized by
neurodegeneration, cardiomyopathy, and diabetes, resulting from reduced synthesis of
the mitochondrial protein frataxin. It is the most common ataxia among the caucasian
population. The research developed in in patient cells and model organisms such as
yeast, worm, fruitfly and mouse have suggested several hypotheses on the frataxin
function, but the full physiology of frataxin in mitochondria has not been well
established yet. In our laboratory, the Drosophila frataxin gene (fh) was isolated. Very
recently Drosophila has become an excellen model to study human diseases given that
humans and flies have in common the most important biological processes, for example
development and degeneration of nervous system, heart development, mitochondrial
metabolic pathways, etc... In this work, we have carried out the study of the Drosophila
frataxin function using three strategies: insertional P element mutagenesis, RNAi
system and overexpression. The insertional mutagenesis was unsuccessful because fh is
a small gene that lies in a crowed genomic region and is surrounded by two and even
three insertional hotspots. Then we began to use a second approach based on the
generation of transgenic flies overexpressing and reducing the Drosophila frataxin
homolog gene by means of the UAS-GAL4 system. Full lethality, phenotypic alterations
or misbehaviours (climbing deficits and shortened life span) were achieved when this
gene was overexpressed or knocked down in a general or mesodermal patterns and in
the PNS (the most affected tissues in the patients) due to the appearance of
developmental defects in muscle, heart and nervous system. Our results showed that
both an excess or a reduction of frataxin expression disturb development of muscular
and nervous systems in Drosophila. As in humans, the damages are mainly focused on
the Drosophila peripheral nervous elements (sensory and motor axons and neurons).
Moreover, important defects have also been observed in mesodermic derivates such as
somatic muscles, cardial and pericardial cells. However, the defects have only been
provoked when the misexpression was carried out in the earlier stages of muscle and
nervous system development.
All these data together suggest that D. melanogaster could be an appropiate model
organism to study Friedreich ataxia.

Un modelo en Drosophila del mecanismo de patogénesis de las expansiones ctg en la distrofia miotónica.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:29 GMT

Un modelo en Drosophila del mecanismo de patogénesis de las expansiones ctg en la distrofia miotónica. Monferrer Sales, Lidón La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular que se debe a
una expansión de repeticiones CTG inestables en la región 3' no traducida del gen
proteína kinasa de la DM (DMPK). La DM1 se caracteriza por la miotonía y distrofia
muscular que muestran los pacientes, los cuales también presentan cataratas,
arritmias cardiacas y alteraciones neuropatológicas. A nivel bioquímico muestran
defectos en el procesado alternativo de pre-mRNAs específicos lo cual explica algunos
síntomas definitorios de la DM1. El mecanismo de patogénesis se debe a la toxicidad
de los RNAs con expansiones CUG para la célula. Varias proteínas de unión a RNA,
como las proteínas humanas Muscleblind-like MBNL1-3 son secuestradas por los
transcritos mutantes DMPK. Las proteínas MBNL colocalizan con los foci ribonucleares
CUG dentro de los núcleos de músculo y neuronas de pacientes DM1. Existen
defectos asociados a DM1 en ratones knockout para Mbnl1 y en moscas mutantes
muscleblind. Nos propusimos generar un modelo en Drosophila de la DM1 para
entender su mecanismo molecular y celular. En primer lugar comprobamos que las
proteínas Muscleblind de Drosophila y la humana MBNL1 eran homólogos funcionales.
Un modelo basado en secuestrar la proteína Muscleblind endógena con RNAs
portadores de repeticiones CUG sólo sería relevante desde el punto de vista
biomédico si la proteína de Drosophila y la humana realizan funciones equivalentes.
Una vez demostrada la conservación funcional entre ambas proteínas mediante el
rescate del fenotipo mutante muscleblind expresando la proteína humana, generamos
moscas transgénicas capaces de expresar 60 y 480 repeticiones CUG en un transcrito
no codificante bajo el control del sistema GAL4/UAS. Detectamos que los RNAs de
480 repeticiones CUG formaban inclusiones nucleares y que Muscleblind era
secuestrada por estos transcritos tal y como ocurre en pacientes DM1. La expresión
de RNAs (CUG)480 en músculo mostró una reducción dependiente de la edad en el
tamaño de la fibra de los músculos indirectos del vuelo y un aumento en el número de
vacuolas. Analizamos el patrón de procesado de la α-actinina, un gen muscular, en
moscas que expresan RNAs (CUG)480 y se observó una alteración en los niveles de
isoformas. En pacientes también se ha descrito una degeneración en las células de la
retina y una pérdida en las neuronas fotorreceptoras. Analizamos la retina de las
moscas modelo que expresaban RNAs (CUG)480 en el disco de ojo-antena y mostraron
alteraciones en la adhesión de las células subretinales y la falta de los rabdómeros de
los fotorreceptores. Externamente mostraban un fenotipo de ojo rugoso y ligeramente
más pequeño que utilizamos para comprobar mediante una combinación alélica de
pérdida de función de muscleblind que las repeticiones CUG estaban interfiriendo
genéticamente con la función de este gen. Realizamos una búsqueda de
modificadores dominantes con este fenotipo ojo rugoso para identificar genes
potencialmente relacionados con el mecanismo de patogénesis de la enfermedad.
Identificamos los genes viking y thread entre otros como modificadores y los
agrupamos en cinco categorías en función del proceso celular en el que estuvieran
actuando; factores de transcripción reguladores, reguladores de la estructura de la
cromatina, adhesión celular, apoptosis y metabolismo del RNA. Finalmente
comprobamos in vivo si los RNAs CUG podían ser una fuente de siRNA o miRNAs. La
expresión de estos RNAs de doble cadena incrementaron los niveles de transcritos de
muscleblind por un mecanismo desconocido. En resumen, hemos demostrado que
estas moscas reproducen aspectos de la enfermedad humana DM1 y pueden
utilizarse para el estudio de la misma.; Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease involving the expansion
of unstable CTG repeats in the 3´ untranslated region of the DM protein kinase (DMPK)
gene. DM1 is multisystemic and characteristic features include myotonia, muscular
dystrophy, cardiac arrhythmias, and neuropathology. A biochemical hallmark of DM1 is
misregulated alternative splicing of specific skeletal muscle, heart and brain premRNAs.
In mice, expression of 250 CUG repeats within a heterologous RNA gives rise
to DM1-like phenotypes demonstrating that expanded CUG repeat transcripts are toxic
to cells. RNA binding proteins, most notably human Muscleblind-like proteins MBNL1-3
are sequestered by mutant DMPK transcripts. MBNL proteins co-localize with CUG
ribonuclear foci within muscle and neuron nuclei in DM1 patients. DM1-associated
defects are remarkably similar to those observed in Mbnl1 knockout mice and
muscleblind mutations in Drosophila provide additional examples of DM1-like
alterations. To understand this toxic RNA gain-of-function mechanism we developed a
Drosophila model expressing 60 and 480 CUG repeats in the context of a nontranslatable
RNA. Previously, we showed that MBNL1 rescues a muscleblind loss-offunction
phenotype, thus demonstrating functional conservation. CUG-expressing flies
reproduced aspects of the DM1 pathology, including nuclear accumulation of CUG
transcripts, dystrophic muscles that degenerate with age, splicing misregulation, and
reduced Muscleblind activity (evident from the enhancement of CUG-induced
phenotypes by a decrease in muscleblind dose). Targeted expression of CUG repeats
to the developing eye was toxic originating eyes externally rough and smaller than
normal. This phenotype was utilized to identify 15 genetic modifiers. These included
viking and thread, which suggest cellular processes previously unknown to be altered
by CUG repeat RNA such as cell adhesion, programmed cell death, nuclear-cytoplasm
export complex ECJ, and chromatin remodelling. We also explored the possibility that
CUG repeat RNA could be a source of small interfering RNAs, thus silencing
transcripts containing complementary sequences such as muscleblind transcript
themselves. Surprisingly, we detected an increase of muscleblind mRNA in CUGexpressing
flies. To sum up, here we describe Drosophila flies that reproduce aspects
of the human disease DM1 and that can find application in the study of DM1.

Implicación del cromosoma X en el retraso mental hereditario: Identificación y caracterización de genes candidatos.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:27 GMT

Implicación del cromosoma X en el retraso mental hereditario: Identificación y caracterización de genes candidatos. Martínez Garay, Isabel El término retraso mental se emplea para definir las dificultades en la adquisición de procesos cognitivos y adaptativos que presenta un determinado porcentaje de la población. Este porcentaje oscila en torno al 0,3%-0,5% para los casos graves a moderados y asciende al 2%-3% si se consideran también los casos leves. El retraso mental constituye, por tanto, un problema social y sanitario que se agrava en ambos sentidos cuando se trata de una condición hereditaria. Diversos estudios señalan desde hace años que, en concreto, el retraso mental ligado al cromosoma X es una de las principales causas de déficit psíquico leve y moderado, con una incidencia acumulada estimada en 1:300 a 1:600 varones. Dentro del retraso mental se distinguen, además, formas sindrómicas, cuando éste aparece asociado a otros síntomas de tipo somático, comportamental, neurológico o metabólico, o inespecíficas, si es el único síntoma que presenta el paciente. En este trabajo se ha abordado el análisis de varias familias afectadas de retraso mental inespecífico ligado al cromosoma X, así como de una familia afectada por el síndrome de Prieto, otra afectada por el síndrome de Lenz, y un paciente esporádico con síndrome de Coffin-Lowry. El análisis se ha centrado principalmente en dos regiones: Xp22 en los casos inespecíficos, y Xq11.4 en los sindrómicos, aunque también se han analizado dos genes en Xq24-q25. En la región cromosómica Xp22 se ha estudiado una región de 2,82 Mb, candidata a albergar el gen mutado en 6 familias. Esta región contiene 19 genes, de los que 13 fueron analizados en dichas familias por ser los mejores candidatos. En uno de ellos, FLJ14503, se ha detectado el cambio c.1734G>T, que no ha podido ser identificado en secuencias de las bases de datos ni en muestras procedentes de controles no afectados de retraso mental. Su análisis ha permitido clasificar la proteína que codifica como una nueva proteína asociada a microtúbulos, pero su implicación en el retraso mental aún no ha sido probada, dado que el análisis en células CHO-K1 de la localización subcelular de la proteína, así como del efecto de su sobreexpresión, no ha permitido todavía catalogar dicho cambio como patológico.
En la región Xp11.4 se analizaron mediante secuenciación otros 13 genes, sin que ninguno de ellos haya podido ser relacionado hasta el momento con el síndrome de Prieto. Tampoco el análisis cuantitativo de 6 de ellos mostró diferencias significativas entre la expresión de pacientes y controles.
El análisis del caso esporádico de síndrome de Coffin-Lowry ha permitido identificar una inserción de un elemento LINE L1 defectivo en el gen RPS6KA3 como la causa molecular de la patología presentada por el paciente. La inserción se ha producido cerca del sitio dador del intrón 3, provocando el skipping del exón 4, lo que conlleva un desplazamiento de la pauta de lectura y la aparición de un codón de parada prematuro.
En el caso de la familia afectada por el síndrome de Lenz, se ha identificado la mutación responsable en el gen PQBP1, situado en Xp11.23. De esta forma se amplían tanto la heterogeneidad alélica de este gen, responsable de otros síndromes y de retraso mental inespecífico, como la heterogeneidad génica del síndrome de Lenz, por tratarse del tercer locus asociado a esta enfermedad.; Due to its relative high prevalence, mental retardation constitutes a social and a health problem, and it worsens in the case of hereditary conditions. Several studies have shown that X-linked mental retardation can especially be regarded as one of the major causes of mild to moderate intellectual handicap, showing a cumulative incidence of 1:300 to 1:600 males. In this work we have analysed nine different families: seven of them were affected by non-specific X-linked mental retardation, one suffered from Prieto syndrome and another from Lenz syndrome. In addition, a sporadic patient of Coffin-Lowry syndrome was analysed for mutations in the RPS6KA3 gene. In the case of the non-specific forms, we focused mainly in the Xp22 region, where 13 genes were screened for mutations. The patients of one family displayed a nucleotide change in one of these genes (FLJ14503), that could not be found neither in database sequences nor in control samples. Analysis of the protein encoded by this gene revealed that it might be a novel microtubule associated protein, but its implication in mental retardation remains yet to be proven. Two other genes were screened in Xq24-q25, but no mutations were found. In order to identify the gene responsible for the Prieto syndrome, 13 genes in the Xp11.4 region were screened by sequencing, but none of them could be implicated in the disease. A two base pair deletion in the PQBP1 gene was found to be the cause of the disease phenotype in the Lenz syndrome affected patients. This finding does not only broaden the allelic heterogeneity already described for PQBP1 mutations, it also increases the genetic heterogeneity of the Lenz syndrome itself, as PQBP1 would be the third locus associated with the disease. Analysis of the RPS6KA3 gene showed a de novo insertion of a defective LINE L1 element as the responsible mutation in the Coffin-Lowry patient. The element has inserted close to the splice donor site of intron 3, leading to the skipping of exon 4 in the processed mRNA and the disruption of the reading frame.

Muscleblind, relevancia clínica y análisis de la función molecular en Drosophila melanogaster.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:27 GMT

Muscleblind, relevancia clínica y análisis de la función molecular en Drosophila melanogaster. Pascual Lucas, Maya Las proteínas Muscleblind humanas, MBNL1, MBNL2 y MBNL3, son factores de splicing alternativo que se unen a sus pre-mRNAs diana mediante un nuevo dominio de dedos de zinc del tipo CCCH que esta conservado evolutivamente. Las proteínas MBNL están implicadas en la ruta de patogénesis de la Distrofia Miotónica (DM) ya que son secuestradas por la expansión del trinucleótido CUG presente en los mRNA mutantes de los genes DMPK (DM1) y ZNF9 (DM2). De acuerdo con el fenotipo de la DM, las mutaciones por pérdida de función en el gen muscleblind (mbl) de Drosophila afectan a la diferenciación terminal de la musculatura y los fotorreceptores. Sin embargo, no se conoce la función molecular de las proteínas Mbl en organismos modelo de invertebrados tales como Drosophila. En este trabajo mostramos que los tres genes MBNL humanos son parálogos, que tienen un patrón de expresión regulado a lo largo del desarrollo y que sus pre-mRNAs sufren un complejo patrón de procesado alternativo que genera distintas isoformas proteicas. Un estudio evolutivo muestra que las proteínas Mbl están presentes en todos los Bilateria y que se caracterizan por la presencia de, al menos, dos dedos de zinc del tipo CX7CX6CX3H. En humanos describimos un polimorfismo en la región 5´ no traducida del gen MBNL1 y analizamos su posible relevancia como modificador genético del fenotipo de la DM. Además, descartamos la presencia de mutaciones en la región codificante de MBNL1 en pacientes con DM sin expansión en el gen DMPK y en pacientes con Retinitis pigmentosa tipo 3. También descartamos mutaciones en la región codificante de MBNL3 en pacientes con Ptosis congénita asociada al cromosoma X. En Drosophila, hacemos un rastreo genético de modificadores dominantes del fenotipo de sobreexpresión de muscleblind en ojo. Los genes que interaccionan genéticamente se pueden agrupar en tres categorías generales: (1) Metabolismo del RNA, que incluye componentes del exon junction complex (EJC) tales como Aly y factores de splicing como nonA; (2) Regulación de la Transcripción, que incluye tanto proteínas que regulan la estructura de la cromatina (Jumeaux) como activadores de la transcripción (Dp), y (3) Control de la Apoptosis, que incluye tanto genes proapoptóticos (thread) como antiapoptóticos (Traf). Además, en este trabajo generamos moscas transgénicas que expresan la proteína de fusión MblC:GFP y las usamos para llevar a cabo experimentos de co-immunoprecipitación (coIP) con el fin de identificar proteínas que interaccionen físicamente con Mbl. Como resultado, hemos identificado seis bandas que coIP in vivo con la proteína de fusión MblC:GFP. Mediante la técnica de Western blot, descartamos la presencia en el coIP de MblC:GFP de algunas proteínas candidatas como Jumu, Aly, Amos y NonA. Este resultado nos permite concluir que estas cuatro proteínas no interaccionan físicamente con Mbl, al menos bajo las condiciones experimentales testadas.; Human Muscleblind proteins MBNL1, MBNL2 and MBNL3 are alternative splicing regulators that bind pre-mRNAs through an evolutionarily conserved tandem CCCH zinc finger domain. MBNL proteins have been implicated in the pathogenetic pathway of the Myotonic Dystrophy (DM) as they are sequestered by the CUG triplet repeat expansion-containing mRNAs of mutant DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. In agreement with the DM phenotype, Drosophila muscleblind (mbl) loss-of-function mutations impair terminal differentiation of muscle and photoreceptor cells. However, little is known about the molecular function of Mbl proteins in invertebrate model organisms. In this work, we report that the three human MBNL genes are paralogues, their expression pattern is developmentally regulated and their pre-mRNAs undergo a complex alternative splicing regulation generating several protein isoforms. An evolutionary study shows that Mbl proteins are present in all Bilateria and are characterized by the presence of, at least, two CX7CX6CX3H zinc fingers. In humans, we describe a polymorphism in the 5´ untranslated region of the MBNL1 gene and analyze its potential relevance as a genetic modifier of the DM phenotype. Moreover, we discard mutations in the coding region of the MBNL1 gene in DM patients showing no CTG expansion in the DMPK gene and in patients with Retinitis Pigmentosa type 3. We also discard mutations in the coding region of the MBNL3 gene in patients with X-linked Congenital Isolated Ptosis. In Drosophila, we made a genetic screen for dominant modifiers of a muscleblind overexpression phenotype in the eye. Genes that genetically interact with mbl fall into three broad categories: (1) RNA metabolism, including components of the exon junction complex (EJC) such as Aly and splicing factors such as nonA; (2) Transcription regulation, which includes chromatin structure regulators (Jumeaux) and transcription activators such as Dp, and (3) Apoptosis control, including both proapoptotic (thread) and antiapoptotic (Traf) genes. In addition, we generated transgenic flies expressing a MblC:GFP fusion protein and used them to perform co-inmunoprecipitation (coIP) experiments to uncover proteins that physically interact with Mbl. We identified six bands specifically coIP with the MblC:GFP fusion protein and discarded Jumu, Aly, Amos and NonA as Mbl molecular partners.

Evolución del virus de la hepatitis C en muestras hospitalarias de la Comunidad Valenciana

Tue, 12 Apr 2011 19:07:25 GMT

Evolución del virus de la hepatitis C en muestras hospitalarias de la Comunidad Valenciana Jiménez Hernández, Núria Aproximadamente 170 millones de personas en el mundo se encuentran infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC). La gran heterogeneidad del mismo, permite distinguir hasta 6 genotipos y más de 50 subtipos, los cuales presentan diferencias en cuanto a su prevalencia, distribución geográfica y rutas de transmisión. Sin ir más lejos, en la Comunidad Valenciana, el VHC está presente en casi el 3% de la población. Los genotipos mayoritarios presentes, corresponden al 1b y 1a, siendo el 1b mucho más prevalente que el segundo. Así pues se plantea el principal objetivo de esta tesis: ¿Qué hace al genotipo 1b ser más prevalente en la Comunidad Valenciana que el 1a? Dos regiones del genoma del virus han sido utilizadas para llevar a cabo este estudio: la comprendida entre la proteína E1-E2, con una extensión de 472 nucleótidos y que contiene a la región hipervariable HVR1, y otra región de 743 nucleótidos de la proteína NS5A que contiene a la región ISDR, obteniendo un número aproximado de 10.000 clones.
Para contestar a la pregunta que se plantea como principal objetivo llevamos a cabo diferentes estudios tales como el cálculo de diferentes medidas de variación genética, la inferencia de la historia demográfica, el desarrollo de distintos tests de neutralidad y la búsqueda de selección positiva en ambas regiones.
Con respecto al primero, no encontramos diferencias significativas al llevar a cabo la comparación de las medias de los diferentes parámetros empleados, por lo que no parece, por tanto, que la variación genética esté relacionada con la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.
Uno de los factores que parece influir en la diferente distribución geográfica y prevalencia de los genotipos es la ruta por la cual se transmite la enfermedad. La utilización de métodos basados en la teoría de la coalescencia puede ayudarnos a reconstruir la historia epidémica de diferentes secuencias del VHC, a partir de la diversidad genética viral presente. Uno de estos métodos es el que hemos utilizado aquí para inferir la historia demográfica del VHC para los genotipos 1b y 1a. Este análisis se llevó a cabo a dos escalas: individual y genotípica. El estudio a escala genotípica parece apoyar la hipótesis de que la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro se deba a las diferentes rutas de transmisión. Ya que por un lado, las vías de contagio muestran una clara relación entre la ruta de transmisión y un determinado genotipo, en este caso el 1b con transfusiones y el 1a con ADVP. Por otro lado la fecha en que el genotipo 1b comienza a disminuir su tasa de crecimiento parece coincidir con el aumento en 1a, y a su vez coincide con la primera introducción de métodos de screening de sangre contra no-A no-B en transfusiones. Por tanto, parece que en los últimos años el contagio vía transfusiones de sangre, debido a las fuertes medidas de control sobre los productos sanguíneos, está casi totalmente controlado, por lo que la infección del virus (genotipo 1b) por esta ruta es muy difícil, dejando vía libre al contagio por ADVP (genotipo 1a).
Los dos últimos estudios apuntan hacia desviaciones al modelo neutral, las cuales, se deben a la acción de la selección positiva en el caso de la región E1-E2, favoreciendo la resistencia al ataque del sistema inmune y negativa en el caso de la región NS5A, impidiendo la acumulación de mutaciones en la ISDR y favoreciendo la replicación viral. Estos resultados son similares en ambos genotipos, por lo que no serían responsables de la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.
Así pues tras todos los análisis realizados podemos concluir que según nuestros resultados, la diferente ruta de transmisión que parecen seguir los genotipos a y 1b, sería responsable de la mayor prevalencia del genotipo 1b sobre el 1a.; Hepatitis C virus is present in 2% of the human population. It is characterised, phylogenetically, by the presence of a number of major genotypes, with a star-like phylogenetic distribution, and composed by several minor subtypes. The most abundant genotype in Europe is called 1, with two prevailing subtypes, 1a and 1b. In order to explain the higher prevalence of subtype 1b over 1a, we have carried out several large-scale sequence analysis, such as: analysis of polimorphisms, analisys of variance inference of demographic history, neutrality test and search of amonoacidical positions under positive selection. Two regions have been used for this task: one compressing the HVR1 (hypervariable region 1) and other including ISDR (Interferon sensitive determinig region) from 100 viral clones of each one of 25 patients subtype 1a and 25 1b, from the Comunidad Valenciana (Spain).
Neither analysis of polimorphisms nor analysis of variance showed differences between subtypes, only the demographic history of the populations reflected some relation with regard to the route of transmission. By other hand we have found several positions in HVR1 under positive selection that coincide in both subtypes, therefore this situation neither explain difference in prevalence. Nevertheless the presence of mutations due to positive selection, could be indicating a mechanism of virus to scape from de attack of immune system. In contrast we observe the absence of positive selection in region ISDR. This absence could be favoring the resistance to interferon and the viral replication. This last situation is similar in both subtypes too.
Therefore and in general, our results showed that route of transmission could be the cause of the highest prevalence of subtype 1b over 1a.

Estrategias de alimentación y cultivo de la dorada (sparus aurata). Regulación endocrina y estado inmunopatológico.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:24 GMT

Estrategias de alimentación y cultivo de la dorada (sparus aurata). Regulación endocrina y estado inmunopatológico. Mingarro Martí, Mónica En la presente tesis doctoral se abordó la regulación de la somatolactina (SL) y del eje somatotrópico (GH-IGF-I) en tres ciclos de engorde con inicio en distinta época del año (primavera, verano y otoño). Se determinaron variaciones estacionales de GH e IGF-I con picos en el periodo estival y los niveles más bajos en otoño e invierno. Los niveles circulantes de GH estuvieron correlacionados positivamente con las tasas de ingesta de alimento, mientras que los niveles de IGF-I lo estuvieron con las tasas de crecimiento. En la SL también se observó variaciones estacionales, pero el pico se estableció en otoño, una vez los animales hubieron alcanzado un determinado estatus energético. Ello mostró una regulación estacional opuesta entre GH y SL. Los valores de SL no coincidieron con los aumentos de cortisol. Como hipótesis de trabajo se estableció que los incrementos de GH actuarían movilizando energía en momentos de déficit energético promoviendo el crecimiento, mientras que los incrementos de SL, una vez el animal hubiera alcanzado cierta disponibilidad energética, servirían para movilizar las reservas energéticas y disparar procesos fisiológicos como el ayuno invernal y la reproducción.
Para comprobar esta hipótesis, se llevó a cabo un modelo de alimentación restringida anual. Se utilizó el mismo diseño experimental de tres engordes del capítulo anterior con dos grupos de alimentación, uno ad limitum (saciedad visual) y otro con alimentación restringida. El valor medio de la restricción en todos los engordes fue del 20%. La restricción de la alimentación comportó un aumento de la amplitud del pico de GH, corroborando que esta hormona es utilizada por el animal para movilizar energía en situaciones de déficit energético. En el caso de la SL, la restricción ocasionó un retraso del pico otoñal, corroborando la hipótesis de que se trata de una señal de adiposidad. Estos cambios hormonales se produjeron cuando existieron también cambios en el contenido graso de los animales. Desde un punto de vista práctico, la alimentación restringida comportó una ligera disminución de la biomasa final (<7%), sin embargo, mejoró la tasa de conversión del alimento en todos los grupos (15%) y disminuyó el grado de adiposidad de los animales. Los beneficios de esta alimentación restringida fueron mayores cuanto más alejado estuvo el ciclo de engorde del modelo natural de la dorada en estado salvaje.
También se estudió el efecto de esta alimentación restringida sobre el estado inmunopatológico de los animales, ya que experiencias previas pusieron de manifiesto la relación entre la adiposidad y este estado inmunopatológico en otras especies de peces. En este caso, la alimentación restringida comportó una menor tasa de mortalidad, menos alteraciones histopatológicas y una menor prevalencia de infección para la mayoría de los parásitos detectados. Asimismo, esta restricción parece mejorar el estado de inmunocompetencia en algunos aspectos (estallido respiratorio).
Otro de los aspectos abordados fue la caracterización del receptor de GH (RGH) en dorada, como pieza clave dentro del eje somatotrópico y para la determinación más precisa del estado nutricional de los animales en cultivo. La secuencia nucleotídica (1726 nt de longitud) codifica para una proteína de 575 aminoácidos de pauta abierta de lectura. El análisis de dicha secuencia se completó por 3' y 5'RACE, encontrándose un péptido señal de 38 aminoácidos, seguido de una región extracelular de 227 aminoácidos, una región transmembrana de 24 aminoácidos y el resto perteneciente a la región intracelular. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas del RGH de dorada con el de otros receptores de vertebrados superiores e inferiores mostró la conservación de 7 cisteínas, 5 sitios N-glicosilación (1 de ellos exclusivo de peces) y el motivo FGEFS en la región extracelular. En la región intracelular se encontraron conservados los Dominios 1 y 2 citoplasmáticos y 8 tirosinas (1 de ellas exclusiva de peces).
La búsqueda de isoformas del RGH de dorada por Northern blot, 3'RACE y screening mediante RT-PCR del extremo 3' no reflejó la existencia de un procesamiento alternativo del ARN mensajero. El análisis de cross-linking también abogaron por la existencia de una única proteína con distinto grado de glicosilación. El análisis de la estructura genómica del RGH de dorada y rodaballo mostró un alto grado de conservación de la estructura exón-intrón, con la presencia de un intrón exclusivo de peces que, en la chopa, posibilita la existencia de una forma larga con una inserción de 93 pb en la región intracelular. En el caso del rodaballo, la región divergente y el 3'UTR de la forma truncada anclada a membrana están codificados por el extremo 5' del intrón 9/10. Todo ello pone de manifiesto que la presencia de isoformas y los mecanismos de generación de los RGHs de peces y vertebrados superiores son marcadamente específicos.; Aquaculture production of gilthead sea bream has largely increased over the past decade, and research in this sector is being directed towards the improvement of feeding practice. In this scenario, the most suitable approach for culturing fish would be the use of appropriate feeding standards aimed not only to improve economic returns, but also to develop a lasting cohabitation of sustainable aquaculture and a cleaner environment. In this way, available data indicate that the potential benefits of high-energy diets can be compromised in gilthead sea bream by unrestricted feeding. In addition, the growth hormone spurts of summer is concurrent with up-regulation of circulating levels of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-I (IGF-I). This endocrine arrangement provides an integrated signal for growth and perhaps immune status at times of increasing daylength and temperature. Furthermore, there is a direct evidences for the involvement of somatolactin (SL), a new member of GH and prolactin family. This hormone is up-regulated by the increase of ration size, and their rise and fall is a consistent event after the summer repletion of energy reserves.
By other side, restricted feeding regime had lower percent mortality, lower prevalence of infection of the most of the detected parasites, less histopathological alterations than those fed under visual satiety, and seemed to be enhanced respiratory burst activity.
Finally, molecular characterization of GH receptor in gilthead sea bream, genomic organization of this receptor in sea bream and turbot and season expression were focused.

Caracterización bioquímica y funcional de la proteína MnmE de Escherichia coli, una proteína esencial implicada en la modificación de los tRNAs.

Tue, 12 Apr 2011 19:07:24 GMT

Caracterización bioquímica y funcional de la proteína MnmE de Escherichia coli, una proteína esencial implicada en la modificación de los tRNAs. Martínez Vicente, Marta El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar, bioquímica y funcionalmente, una GTPasa bacteriana, la proteína MnmE de E. coli, implicada en la modificación postranscricional de algunos tRNAs.

MnmE es una proteína multidominio de 50 kDa que consta de un dominio N-terminal de ~220 residuos, un dominio medio de unión a GTP (dominio G) de ~160 residuos y un dominio C-terminal de ~75 aminoácidos que contiene la única cisteína presente en la molécula. MnmE es una GTPasa cuyas propiedades bioquímicas difieren ampliamente de las mostradas por las GTPasas reguladoras pertenecientes a la familia de las pequeñas GTPasas, típicamente representadas por Ras. MnmE tiene muy baja afinidad por nucleótido y una actividad GTPasa intrínseca alta; además, es capaz de multimerizar. El ciclo GTPasa funciona in vitro sin necesidad de factores adicionales tipo GAPs o GEFs. El dominio G de MnmE aislado conserva una afinidad similar por nucleótidos y la misma capacidad de hidrólisis del GTP que la proteína entera y, sin embargo, no presenta ningún subdominio activador GAP insertado, demostrando que MnmE es un nuevo ejemplo de proteína GTPasa que presenta un mecanismo de activación diferente al dedo de arginina.
En este trabajo se ha demostrado que la hidrólisis del GTP realizada por la proteína MnmE es esencial para la función modificadora de los tRNAs. En nuestro modelo proponemos que la hidrólisis del GTP provoca los reordenamientos estructurales en la molécula que le permiten ejecutar su función modificadora. Si es así, MnmE sería el primer ejemplo de una enzima modificadora de tRNAs con actividad GTPasa.

Además, en este trabajo hemos establecido la relación entre la presencia de la modificación introducida por MnmE en los tRNAs y la viabilidad celular, demostrando la importancia de la modificación química post-transcripcional para el proceso de descodificación celular, pues este proceso se ve gravemente perjudicado cuando mutaciones que inactivan funcionalmente MnmE se combinan con mutaciones en otros genes implicados en este proceso y que por sí solas no producen fenotipo aparente.; The Escherichia coli MnmE protein is a high evolutionarily conserved protein with GTPase activity. MnmE has a molecular mass of 50 kDa and is organized as a multidomain protein consisting of an ~220 amino acid N-terminal domain, a middle GTPase domain of about 160 residues, and a ~75 amino acid C-terminal domain, wich contains the only cysteine residue present in the protein.
MnmE exhibits a very high intrinsic GTPase activity rate and low affinity for GTP and GDP and it can form self-assemblies, these unusual biochemical properties differs extensively MnmE from regulatory GTPase proteins such Ras.

In vitro, the GTPase cycle works without any additional factor such GAPs or GEFs. The isolated GTPase domain roughly conserves the guanine binding and GTPase activities of intact MnmE molecule and strinkingly doesn't present any inserted activation subdomain. MnmE is a new example of a GTPase protein that follows an alternative activation mechanism without an arginine finger.

MnmE is involved in the modification of the uridine at the wobble position of certain tRNAs. In this work we examine the biochemical and functional consequences of altering amino acid residues within the GTPase and C-terminal domain of MnmE. Our results indicate that the MnmE tRNA modifying function requieres effective hydrolysis of GTP and not only GTP binding as in most of the GTPases. We propose that MnmE uses the conformational change associated with GTP hydrolysis to promote the tRNAs modification reaction, in witch the C-terminal Cys may function as a catalytic residue. We also demonstrate thet point mutations abolishing the tRNA modifying function of MnmE confer synthetic lethality wich stresses the importance of the tRNA modification function in the mRNA decoding process.

Desarrollo de marcadores moleculares de aplicación en genómica y programas de mejora de cítricos

Tue, 12 Apr 2011 19:07:23 GMT

Desarrollo de marcadores moleculares de aplicación en genómica y programas de mejora de cítricos Ruiz Lafora, Carlos Los cítricos son las especies frutales más importantes a escala mundial, siendo actualmente España el cuarto país productor. Esto contrasta con la escasez de estudios genéticos para su mejora, lo cual es debido a que presentan varios problemas, entre ellos su compleja biología reproductiva. Muchas especies de cítricos son apomícticas y sus semillas producen embriones nucelares que limitan el desarrollo de embriones zigóticos y por tanto, la construcción de familias segregantes. En los programas de mejora de cítricos y en los viveros es muy importante distinguir entre individuos zigóticos y nucelares para poder eliminar los genotipos no deseados. Normalmente, los isoenzimas se han empleado para determinar el origen genético de las plantas jóvenes. En el primer trabajo se propone el uso de marcadores microsatélites como una metodología alternativa y los comparamos con los isoenzimáticos para la distinción de plántulas zigóticas. Con objeto de facilitar el análisis de microsatélites se desarrolló también un protocolo rápido de extracción de ADN y un método de alta resolución y fácil revelado sin utilizar fluorocromos ni radioisótopos.
Se emplearon dos familias segregantes: una derivada de un cruce interespecífico entre Poncirus trifoliata (L.) Raf. Var. "Flying Dragon" y el tangor "Ortanique" (Citrus reticulata (Blanco) x Citrus sinensis (L.) Osb.), familia PxO, la otra familia analizada fue obtenida por autofecundación de Fortunella crasifolia Swing., familia Fc.
En el cribado de las plántulas PxO únicamente fue necesaria la utilización de un marcador microsatélite, ya que con éste se pueden distinguir los 4 alelos presentes en la población. En esta misma familia se analizaron otros microsatélites al igual que varios isoenzimas, y con todos se obtuvieron los mismos resultados, el 87% de los individuos de la familia son zigóticos. En familias obtenidas por cruzamiento entre especies muy distantes filogenéticamente, cualquier marcador codominante suele ser útil, sin embargo, cuando los parentales están genéticamente más relacionados, es más difícil encontrar variabilidad en cada locus. Por esto, la eficiencia de los microsatélites aumenta respecto a la de isoenzimas, debido a que presentan mayor grado de polimorfismos. Un caso extremo es la familia Fc, que esta formada por 106 individuos y fue generada por autofecundación. Se analizaron 5 microsatélites y 5 isoenzimas, y se encontraron 6 individuos zigóticos empleando los microsatélites, mientras que con los isoenzimas sólo se pudieron detectar 3 de los 6 observados con los microsatélites. Por tanto, la conclusión de este trabajo es que el empleo de microsatélites presenta mayor eficiencia que el de marcadores isoenzimáticos para identificar plántulas de origen sexual en los cítricos o, en general, plantas de origen desconocido.
Una vez comprobada la gran utilidad que tienen los microsatélites en la mejora genética por su nivel de polimorfismo, rapidez, sencillez y gran repetibilidad que poseen, nos planteamos la obtención de nuevos microsatélites de cítricos. Con este objetivo se emplearon dos estrategias: la construcción de una genoteca de ADN genómico de P. trifoliata con fragmentos de pequeño tamaño, y la estrategia bioinformática consistente en cribar microsatélites empleando el programa FINDPATTERNS en todas las secuencias de cítricos incluidas en GenBank, en las cuales se buscaron todas las posibles repeticiones de di-, tri-, tetra- y pentanucleótidos.
En total se obtuvieron 33 nuevos microsatélites, 6 en el cribado de la genoteca y el resto a partir de las secuencias de la base de datos. Estos nuevos marcadores se emplearon para la realización de mapas genéticos en tres familias segregantes:
- Autofecundación de Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon)
- Citrus aurantium x Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon)
- Citrus volkameriana x Poncirus trifoliata (var. Rubidoux)
Se construyó un mapa para cada uno de los parentales de cada familia, que poseen entre 48 y 120 marcadores, dependiendo de la heterozigosis de cada parental. El análisis comparativo entre genomas fue posible gracias al uso de los marcadores SSR principalmente, observándose varias reorganizaciones entre las distintas especies, así como entre las dos variedades de Poncirus trifoliata. Se observó que el orden de los marcadores en el mapa puede variar al bajar el LOD. Puesto que para futuros análisis genéticos lo más importante es que la ordenación sea la correcta, se prefirió construir los mapas a LOD alto a costa de dejar marcadores fuera de los grupos de ligamiento.
Para la realización de los mapas de ligamiento también se usaron otros tipos de marcadores como los IRAPs, que aunque son menos informativos porque no son codominates, producen gran número de polimorfismos muy repetitivos con pocas combinaciones de cebadores y su distribución en el genoma es, en general, aleatoria.
El análisis de segregación a nivel genómico puso de manifiesto la distorsión en la segregación en ciertas zonas concretas, que corresponderían a problemas gaméticos y/o zigóticos, es decir, presencia de factores letales.
Una vez obtenidos los nuevos marcadores SSRs e IRAPs en cítricos, y sabiendo su localización genómica, nos propusimos utilizarlos para investigar sobre el origen de la variación molecular en el grupo de los mandarinos clementinos, debido a su importancia económica y por tratarse de un reto, ya que es una especie que se propaga vegetativamente, por lo que la variabilidad genética es muy limitada. En general, las nuevas variedades son detectadas por los propios citricultores mediante la identificación de mutaciones somáticas que afectan caracteres agronómicos, tales como la época de recolección.
Se emplearon distintos tipos de marcadores con objeto de comparar su nivel de polimorfismo en una colección de 24 variedades. No se observó ningún polimorfismo al emplear SSR, por lo que la recombinación somática no debe ser una fuente importante de variabilidad en esta especie. Cuando se emplearon ISSRs, RAPDs y AFLPs, sólo un 2.4% de las combinaciones de cebadores produjeron polimorfismos, en comparación con los generados al emplear IRAPs (14.6%). Además, el diagrama evolutivo basado en estos últimos polimorfismos se ajusta bastante bien al origen conocido de algunas variedades.
Por tanto, se concluye que los cambios en el ADN de los retrotransposones y las zonas adyacentes son más frecuentes que en el resto del ADN estudiado. Esto sugiere que los factores que provoquen la actividad de retrotransposones, como condiciones bióticas o abióticas de estrés, pueden ser una fuente importante de variabilidad genética a utilizar en programas de mejora de especies de propagación vegetativa, donde abunden los elementos de este tipo, como es el caso de los naranjos navel o los mandarinos clementinos.; Citrus are one of the major fruit crops in the world. Citrus represents a very wide set of species, but with long juvenile periods, a high level of apomixis and, generally high heterozygosity. This means that genetic studies on citrus are very costly, long and, therefore, scarce.
In citrus breeding and genetics, it is very important to distinguish between zygotic and nucellar seedlings in order to eliminate unwanted genotypes. Usually, isozyme markers have been employed to determine the genetic origin of young plants. We propose the use of SSR markers as an alternative methodology and compare them with isozymes in this kind of screenings.
Constructing genetic linkage maps would permit to compare the organization of different genomes and an efficient and continuous use of plant genetic resources to enrich the gene diversity of breeding programs, supported by markers at the selection stages.
Five genetic linkage maps were constructed for the parents of three progenies. The number of polymorphic markers assayed ranged from 48 to 120, according to the heterozygosity of each parent. Focused on genome comparison, most of the markers were newly generated SSRs. IRAPs based on 4 retrotransposon sequences isolated from Citrus spp were also used to saturate the maps. Genomic reorganisations were observed when comparing the colinearity between Citrus and Poncirus, and also between P. trifoliata varieties.
Clementines, due to their high quality, are one of the most important cultivated citrus mandarins. Genetic variability within this species is minimal when analysed by molecular markers, since the existing varieties have not been obtained through hybridisation, but through the selection of spontaneous mutations affecting traits of agronomic interest.
Different kinds of markers based on primers of random sequence, simple sequence repeats and retrotransposon sequences that may reveal point mutations, somatic recombination and transposon activity, respectively, were used to compare the level of variability among 24 clementine varieties.
Their ISSR, RAPD and AFLP analysis provided only two polymorphic bands. No variability was found by SSRs. The amplification of sequences adjacent to retrotransposons (IRAPs) yielded a higher number of polymorphisms (14.6 % versus 2.4 % for the previous mentioned marker types).