Mutacions

Abstract

Els mecanismes de regulació de l'expressió gènica a bactèries, i concretament a "E.coli", han estat àmpliament estudiats, no nomès per la seva importànica per la comprensió del funcionament de la cel.lula bacteriana, sinó també pel seu interès en el desenvolupament de sistemes d'expressió i producció de proteïnes clonades. És evident que el coneixement dels mecanismes que regulen l'expressió gènica a "E.coli" pot facilitar la manipulació d'aquesta bactèria per tal d'utilitzar-la com a hoste amb la finalitat de produir determinades proteïnes d'interès biotecnològic.<br/><br/>El treball que es presenta en aquesta Tesi comprèn diferents aspectes relacionats amb la mutació "hha", especialment pel que fa referència al seu paper regulant l'expressió gènica a "E.coli" i a la utilització d'aquesta mutació i d'altres amb la finalitat d'augmentar la producció de proteïnes heteròlogues.<br/><br/>Una part del treball es va centrar en l'estudi de diferents aspectes del gen "hha". Aquest gen ha estat identificat en funció del seu paper en la modulació de l'expressió de l'alfa-hemolisina clonada al plàsmid multicòpia pANN202·312 (Godessari el al., 1988). Les soques portadores de mutacions en el gen "hha" lenen incrementada la sinlesi d'hemolisina, Aquesta mutació és pleotròpica, causant efectes similars sobre l'expressió d'algunes proteïnes heteròlogues clonades (Nieto et al., 1987; Blanco et al., 1991; Carmona, Tesi Docloral, 1992). El gen "hha" codifica per la proteïna Hha, d'un pes molecular d'aproximadament 8 kDa. Aquesta proteïna està implicada en els mecanismes de regulació de l'expressió de l'hemolisina, acluant a nivell transcripcional. Els darrers estudis sobre el mecanisme pel qual la proteïna Hha modula l'expressió de l'hemolisina suggereixen que la regulació està relacionada amb canvis en la topologia del DNA (Carmona, Tesi Doctoral, 1992). La comparació de les seqüències d'aminoàcids de la proteïna YmoA de "y. enterocolitica" (Cornelis et al" 1991) i de la proteïna Hha va permetre trobar un elevat grau d'homologia. La proteïna YmoA exerceix un paper en la regulació per temperatura de l'expressió de determinats gens implicats en la virulència d'aquesta bactèria. Resultats preliminars semblen indicar que aquesta regulació es produiria per canvis en el grau de superenrotllament del DNA.<br/><br/>S'ha postulat que aquestes dues proleïnes, Hha i YmoA, formarien part d'una nova familia de proteïnes que modularien l'expressió gènica per canvis conformacionals en el DNA (De La Cruz et al., 1992).<br/><br/>En aquest treball s'han completat i comprovat diferents aspectes relacionats amb la caracterització del gen Ma. Mitjançant la utilització de sondes del gen marcades i les tècniques d'amplificació de DNA per la metodologia de la PCR, s'ha localitzat el gen "hha" al cromosoma d'E.coli. A més a més, s'han realitzat estudis enfocats a determinar quina és la distribució d'aquest gen entre diferents soques d'E. coli i d'altres géneres d'enterobactéries: S. typhimurium, S. marcescens, K. pneumoniae i Y. enlerocolitica. Els resultats mostren una distribució pràcticament homogénia entre les soques d'E.coli que s'han utilitzat, mentre que no és detectable a pràcticament cap altra soca d'enterobacléria. El gen "hha" només ha estat detectat a la soca C3 de K. pneumoniae i a la soca V754 de y. enterocolitica. Tenint en compte que tolo i que les proteïnes Hha i YmoA presenten un elevat grau d'homologia, les sondes del gen "hha" no proporcionen senyals d'hibridació amb el cromosoma de Y.enterocolitica, es qüestiona la utililzació de les tècniques d'hibridació de tipus "Southern" i de PCR com a sistemes de detecció de la producción de proteïnes semblants a Hha o YmoA en els microorganismes analitzats.<br/><br/>Donat l'efecte pleotrópic de la mutació "hha", i amb la finalital de modificar el fons genétic d'una soca d'E.coli per tal d'optimitzar l'expressió de proleïnes clonades, es va plantejar l'obtenció de la mutació "hha" a una soca d' E.coli amb genotip recA, ja que les soques "hha" de les que es disposava fins el moment no eren delicients per les funcions de recombinació homòloga, el que pot implicar la inestabilitat dels plàsmids portadors dels gens que es volen expressar. Utilitzant el transposó TnS com a element mutagènic, es van obtenir mutants hha derivats de la soca HB l01. La caracterització d'aquests clons va conduir a l'observaci6 d'un fenomen inesperat. En les successives ressembres de clons "hha" apareixien colònies no productores d'hemolisina. L'estudi d'aquest tipus de clons va permetre determinar que el seu origen es devia a transposicions secundàries de TnS des de la inserció inicial al gen hha cap al gen hlyA, gen estructural de l'hemolisina clonada a pANN202·312. Aquestes insercions impedeixen la sintesi de la toxina i causen el fenotip no productor d'hemolisina.<br/><br/>L'expressió de proteïnes clonades a E.coli és dependent dels mecanismes de regulación de l'expressió gènica d'aquest microorganisme, Aquests mecanismes poden actuar a nivell transcripcional, a nivel d'estabilitat del missatger, a nivel traduccional i a nivell post-traduccional. En aquest darrer nivell s'inclouen els mecanismes de modificactó post-traduccional, que condueixen a la formació de la proteïna activa, o el transport de la proteïna a la seva localització especifica. Però en aquest mateix nivell també es produeixen fenòmens de degradació proteolitica; aquests mecanismes tenen especial importànica quan es volen expressar proteïnes heteròlogues clonades a E.coli, ja que majoritàriament aquestes proteïnes són degradades. A E.coli es coneixen diferents proteases, però se'n sap molt poc del seu paper en la degradació de proteïnes helerologues, i a més en pocs casos s'han relacionat amb el gen que les codifica (Miller, 1987; Gotessman, 1987). Amb la finalitat d'optimitzar una soca d'E.coli per l'expressió de proteïnes heteròlogues, una part d'aquest treball ha consistit en l'intent de localitzar per mutagènesi gens que codifiquin per proteases intracel.lulars. Per això es va triar un model de proteïna heteròloga que és degradada quan s'expressa a E.coli, la proteïna quimèrica ABI508 clonada al plàsmid pJMKam4 (Bishai el al., 1987). Per l'expressió d'aquesta proteïna es va utilitzar la soca d' E.coli Hha·2 ("hha"), ja que l'expressió de la proteïna ABIS08 també és afectada per la pleotropia d'aquesta mutació, produïnt·se un increment de la seva síntesi (Carmona, Tesi Doctoral, 1992). S'ha posat a punt una metodogia de detecció de clons defectius en activitats proteolitiques intracel.lulars. Malgrat els resultats no han conduït a la identificació de cap mutació que afecti alguna proteasa intracel.lular, la metodologia s'ha mostrat vàlida per aquesta finalitat.<br/><br/>D'altra banda es pretenia cercar altres mutacions, diferents d'hha, que afectin gens que modulin l'expressió de proteïnes heteròlogues, de manera que mutacions en aquests gens puguin proporcionar un augment de la seva expressió. Es va triar un model de proteïna heteròloga expressada a E.coli, l'aerolisina d'Aeromonas hydrophila, toxina amb activitat hemolitica, clonada al plàsmid multicòpia pHPC3·700 (Chakraborty el al., 1986; Nieto el al., 1987). Aquesla toxina és secretada al medi extern a "Aeromonas hydrophila" seguint la via de la seqüència senyal. Quan s'expressa a E.coli, l'aerolisina s'acumula al periplasma (Chakraborty el al., 1986; Howard i Buckley, 1986).<br/><br/>Es van fer experiments de mulagènesi de la soca d' E.coli 5K (pHPC3·700) amb Tn5, amb la finalitat de trobar mutacions que poguessin afectar la sintesi o secreció de l'aerolisina. Els experiments de mutagènesi van conduir a l'obtenció de dos mutants, denominats hap-6 i hap-9 (hap per "high aerolysin production"), que presentaven, a diferència de la soca parental, grans halos d'hemòlisi en plaques d'agar-sang. La caracterització preliminar i el mapatge aproximat de les dues mutacions va mostrar que es tractava de mutacions diferents, pel que es va decidir caracteritzar únicament la mutació hap-9, S'ha estudiat l'expressió d'aerolisina per part de la soca mutant CM209 (hap·9). S'ha comprovat que aquesta mutació modifica tant la sintesi d'aquesta proteïna com la seva secreció al medi extern. S'ha demostrat que la sortida d'aerolisina al medi extern no és deguda a una secreció real de la proteïna, ja que va acompanyada de la presència de determinats enzims periplasmàtics al medi extern. S'ha constatat que l'augment en la producción és moderat, aproximadametl de 1,35 vegades més respecte la soca parental. D'altra banda, l'anàlisi de les envoltes de la soca mutant ha permès constatar que a la membrana externa de les cèl.lules de la soca CM209 hi manca la proteïna LamB, present als extractes de la soca parental.<br/><br/>Així mateix, s'ha pogut observar que l'expressió de l'aerolisina, en el cas de la soca CM209, altera la composició de la membrana externa, afectant la presència i quantitat d'algunes proteïnes de baix pes molecular. També ha estat evidenciada la pleotropia de la mulació "hap-g", demostrant que l'expressió d'una altra proteïna heteróloga, una endoglucanasa de Bacillus polymyxa, està incrementada a la soca CM209.<br/><br/>El mapatge de la mutació "hap-g" per conjugació amb soques Hfr::Tn10 i cotransducció de marcadors amb PI , va permetre localitzar la mitació al minut 16,7 del mapa de lligament del cromosoma d'E.coli, L'estudi dels gens censats en aquesta regió va suggerir que els unics gens que podrien estar relacionats amb la mutació "hap·g" eren els gens tolQRAB. Ha estat descrit que mutacions en aquests gens presenten diversos efectes pleotròpics, entre els que cal destacar l'alliberament de proteïnes periplasmàtiques al medi extern (mutacions "Leary", Webster, 1991). Tant l'anàlisi de l'expressió de l'aerolisina a soques mutants pels gens tolA i tolB, com l'espectre de resistències a colicines de la soca CM209, suggereix que la mutació hap-9 correspon a una mutació en un dels gens tolQ, tolR o tolA. Ja ha estat descrit que mutacions en aquests gens poden causar efectes pleotrópics en l'alliberament de proteïnes periplasmàtiques, i que aquesl electe ptl anar acompanyat d'un moderat increment en la seva sintesi (Fognini-Lelebvre i Ponalier, 1984).<br/><br/>Com a part final del treball, s'ha intentat la construcció d'una soca d'E.coli en la que fa combinació de les mutacions hha i hap·9 pugui contribuir a optimitzar l'expressió de proteïnes heterólogues clonades.

<i>In this work we have studied different aspects concerning the "hha" mutation, and other mutations that could cause an increase in the expression of heterologous proteins cloned into "Escherichia coli". The "hha" gene is involved in regulatory mechanisms of gene expression by changing DNA topology. We have studied the "hha" gene distribution between different strains of "E.coli" and other enteric bacteries: S. typhimurium, S. marcescens, K .pneumoniae and Y. enterocolitica. There is a homology of 83% between the Hha protein and YmoA protein of Y. enterocolilica. Using hybridization and PCR techniques, we have detected the "hha" gene in most of "E.coli" strains, in C3 strain of K. pneumoniae and Y754 strain of Y.enterocolilica. Furthermore, we have isolated mutants "hha" in HB101 (recA), by Tn5 mutagenesis. This study has allowed us to determine a phenomenon of instability of Tn5 insertions in the "hha" gene.<br/><br/>On the other hand, we have developed a methodology in order 10 select mutants in intracellular protease activity. In this work we have isolated a mutation, named "hap-9", that increases the expression of the aerolysin of Aeromonas hydrophila cloned into E. coli. This mutation, which causes a leaky phenotype, was mapped near minute 17.<br/><br/>This suggests us a relation between this mutation and tolQRAB genes. The sensibility to colicins of CM209 strain (hap-9) and the expression of aerolysin in mutant strains in "Tol" genes, indicates that the "hap-9" mutation is caused by an insertion of Tn5 in the gene cluster tolQRA. In addition, we have constructed a strain carrying both the "hha" and the "hap-g" mutations, in order to obtain a strain with optimized expression of heterologous proteins cloned into "E.coli".<br/></i>