Effects of astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 after facial nerve axotomy in the adult mouse

Abstract

Al SNC, la neuroinflamació és un procés desencadenat per varies circumstàncies incloent infeccions, toxicitat, lesió traumàtica o autoimmunitat i sempre implica la ràpida activació de les cèl·lules glials, en particular astròcits i micròglia. Com a major component del sistema immunitari al SNC, la micròglia juga un paper fonamental regulant la neuroinflamació. Un cop activada, la micròglia es transforma, prolifera, migra i secreta molècules immunomoduladores com les citoquines. A la mateixa vegada, les citoquines poden influenciar el fenotip microglial. Així, la IL-6 pot ser un potent inductor i modulador de l’activació microglial, mentre que la IL-10 pot reprimir el fenotip pro-inflamatori de la micròglia. Un dels models millor caracteritzats de lesió de nervi perifèric es la lesió del nervi facial (FNA), caracteritzada per la degeneració neuronal retrògrada, l’activació glial i el reclutament limfocític. Per entendre el paper de la IL-6 i la IL-10 en la regulació de la resposta inflamatòria després de FNA, utilitzem dos soques de ratolins transgènics, GFAP-IL6Tg i GFAP-IL10Tg, que produeixen les citoquines IL-6 i IL-10, respectivament, sota el promotor de GFAP en astròcits. Els nostres resultats demostren que després de FNA, la IL-6 té un lleu efecte atenuant l’activació astroglial, però indueix importants efectes en termes d’activació micròglia, que correlacionen amb una major mort neuronal. Així, trobem que la IL-6 augmenta la densitat microglial i modifica l’expressió de moltes molècules relacionades amb la comunicació cel·lular. La IL-6 produeix una baixada en les molècules d’adhesió microglial, les quals poden afectar la manera com la micròglia es comunica amb les neurones axotomitzades. Remarcablement, la IL-6 indueix menor formació de clústers microglials, qüestionant la noció de que aquests clústers corresponen a llocs de neurones degenerant-se i micròglia fagocítica. També, demostrem que la IL-6 provoca un augment en el nombre de limfòcits-T infiltrats al nucli facial. Tot i que la infiltració de limfòcits-T, especialment els Th2, es considera neuroprotectora en WT, podem especular que la IL-6 indueix el reclutament de limfòcits-T no-neuroprotectors i, per tant, es modificaria la supervivència neuronal. Malgrat els efectes detrimentals en supervivència neuronal als 21 dies, la IL-6 no continua augmentant la mort neuronal 7 setmanes desprès de FNA però sembla que empitjora la regeneració funcional efectiva a aquest temps. Per una altra banda, la IL-10 augmenta la supervivència neuronal comparada amb el WT, correlacionant amb canvis en la resposta microglial i immunitària. Remarcablement, la IL-10 provoca una major formació de clústers de micròglia, demostrant de nou que no hi ha correlació entre el nombre de clústers i la quantitat de mort neuronal. A més, la IL-10 disminueix l’expressió de molècules associades amb la fagocitosis microglial al principi de la lesió. Aquests resultats, conjuntament amb l’observat amb els animals GFAP-IL6Tg, ens duen a proposar que els clústers de micròglia poden tenir unes altres funcions, més enllà de la fagocitosis de residus neuronals. En aquest sentit, la IL-10 incrementa l’expressió de molècules coestimuladores en la micròglia dels clústers, senyalant aquestes estructures com a llocs d’interacció amb els limfòcits-T. Demostrem també que la IL-10 provoca un major reclutament de limfòcits-T al nucli facial, tot i que el mecanisme pel qual els limfòcits-T promouen la supervivència neuronal no ha estat encara aclarit. Malgrat els efectes beneficiosos en supervivència neuronal a 21 dies, la IL-10 no té efectes en aquesta ni en la regeneració funcional efectiva 7 setmanes desprès de FNA. En resum, els resultats obtinguts en la present tesis mostren que la producció dirigida en astròcits de IL-6 i IL-10 modula la resposta neuroinflamatòria orquestrada desprès de FNA i influencien la supervivència neuronal i la regeneració del nervi.

In the CNS, neuroinflammation is a process triggered by a variety of circumstances including infection, toxicity, traumatic injury or autoimmunity and as hallmark always involves the quick activation of glial cells, in particular astrocytes and microglia. As the prime component of the CNS immune system, microglia plays a major role regulating neuroinflammation. Once activated, microglial cells transform, proliferate, migrate and release immunomodulatory molecules like cytokines. In turn, cytokines can strongly influence microglial phenotype. In this sense, IL-6 can be a potent inducer and modulator of microglial activation while IL-10 can downregulate the pro-inflammatory phenotype of microglia. One of the most-well described models of peripheral nerve injury is facial nerve axotomy (FNA), characterized by retrograde neuronal degeneration, glial activation and lymphocyte recruitment. To understand the role of IL-6 and IL-10 in the orchestration of the inflammatory response after FNA, we used two transgenic mice, GFAP-IL6Tg and GFAP-IL10Tg, which produce the cytokines IL-6 and IL-10, respectively, under the GFAP promoter in astrocytes. Our results showed that after FNA, IL-6 elicited a slight effect on attenuating astroglial activation, but induced intensive effects in terms of microglial activation that correlated with a higher neuronal death. Thus, we found that IL-6 increased microglia density and modify the pattern of expression of several molecules related with cellular cross-talk. IL-6 produced a drop in microglial adhesion molecules, which may affect how microglia communicate with the lesioned motorneurons. Importantly, IL-6 led to less microglial cluster formation, calling in question the assumption that these clusters correspond just to places of dying neurons and phagocytic microglia. Also, our findings showed that IL-6 produced an increase in the number of infiltrated T-cell within the lesioned facial nucleus. Although infiltration of T-cells, specifically Th2 lymphocytes, has been reported to play a neuroprotective role in WT, we can speculate that IL-6 induced the recruitment of non-neuroprotective T-cells and therefore modify the outcome of lesioned motor neurons. Despite its detrimental effects in neuronal survival at 21 days, IL-6 did not continue increasing neuronal death 7 weeks after axotomy but seemed to impair effective functional regeneration at this time-point. On the other hand IL-10 promoted an increase in neuronal survival, in front to WT, correlating with changes in microglial and immune responses. Remarkably, IL-10 led to increased microglial clusters formation, showing again no correlation between the number of microglial clusters and the amount of neuronal death. Moreover, IL-10 decreased the expression of molecules associated with microglial phagocytosis during early time-points. These findings, together with the observations in GFAP-IL6Tg animals, lead us to propose that microglial clusters may have another functions rather than phagocytosis of neuronal debris. In this sense, IL-10 increased co-stimulatory molecule expression in clustering microglia, pointing to these clusters as locations of interaction with recruited lymphocytes. We showed that also IL-10 promoted the recruitment of T-cells into the facial nucleus, yet the mechanism by which infiltrated T-cells contribute to enhanced neuronal survival has not been yet elucidated. Despite its beneficial effects on neuronal survival at 21 days, IL-10 was not able to increase neither neuronal survival nor functional regeneration 7 weeks after FNA. In summary, the results obtained in the present thesis show that astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 modulates the neuroinflammatory response orchestrated after FNA and influence the neuronal survival and nerve regeneration.