Evaluación toxicológica in vitro de los efectos producidos por cadmio, plomo, cromo y selenio en células renales y hepáticas a concentraciones encontradas en tres especies de pingüino de la Península Antártica e islas asociadas

Abstract

La contaminación a escala global y local podría estar afectando a una de las hasta ahora consideradas últimas regiones prístinas en el mundo, la Antártida. En estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación fueron detectadas diferentes concentraciones de metales en diferentes tejidos de tres especies de pingüinos de la Península Antártica e Islas asociadas (Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua y Pygoscelis adeliae), considerados especies clave para la monitorización de dichos contaminantes. En la presente tesis se ha llevado a cabo la evaluación in vitro de los efectos producidos por dichas concentraciones de cadmio, plomo, cromo y selenio en dos líneas celulares: VERO, de origen renal y AML12, de origen hepático. Para ello se ha evaluado la citotoxicidad basal y las respuestas celulares asociadas a dicha exposición mediante el estudio de su efecto sobre la viabilidad celular, cambios estructurales y ultraestructurales, modificaciones sobre las distintas fases del ciclo celular, el tipo de muerte celular predominante, el estrés celular y la expresión de diferentes genes relacionados con la protección celular contra la toxicidad de metales (metalotioneína), el estrés celular (Heat-Shock protein-70), el estrés oxidativo (catalasa) y apoptosis (bax). Para evaluar la viabilidad celular se empleó la técnica colorimétrica del MTT, mediante espectrofotometría; para evaluar el efecto sobre el ciclo celular y el tipo de muerte celular se utilizaron los reactivos IP e IP/anexina respectivamente, mediante citometría de flujo; los cambios estructurales y ultraestructurales fueron observados mediante microscopía óptica y electrónica de transmisión; el estrés celular fue estudiado mediante la sonda DCFHA-DA por citometría de flujo y finalmente, el estudio de expresión génica se llevó a cabo mediante qPCR. El ensayo de viabilidad celular mediante MTT muestra que la concentración media de individuos adultos para el cadmio impide la viabilidad celular en la línea celular VERO y sólo permite el 2% en AML12; en el caso del plomo ninguna concentración estudiada afecta de forma acusada sobre la viabilidad celular; el cromo afecta a la viabilidad celular con un porcentaje superior al 70% y dicha viabilidad, disminuye de forma destacada debido a la concentración media hallada en individuos juveniles en VERO y con el selenio la viabilidad celular resulta drásticamente afectada, siendo el porcentaje de células vivas no superior al 4% en ninguno de los casos. Los datos obtenidos sobre los efectos causados en las distintas fases del ciclo celular, muestran que el cadmio en líneas generales provoca en VERO la disminución de la fase G0/G1 y el aumento de la fase S, al igual que en las concentraciones más elevadas en AML12, la CE50 en plomo, el cromo en todos los casos y para las concentraciones más elevadas de selenio (concentración media hallada en individuos adultos, juveniles y pollos). Mientras que concentraciones menos elevadas de cadmio en AML12 (CE50, concentración media hallada en juveniles y pollos) producen el aumento de la fase G0/G1 y concentraciones menores de plomo el aumento de la fase G2/M. Las concentración media hallada en adultos y juveniles de cadmio en VERO y concentración media de adultos en AML12, CE50 del plomo en AML12, concentración media de pollos para el cromo en AML12 y selenio para concentraciones medias de adultos, juveniles y pollos provocan que más del 50% de las células se encuentren en estado de apoptosis o necrosis. En líneas generales, la muerte celular por apoptosis predomina sobre la necrosis. El estudio morfológico muestra que los rasgos más característicos en ambas líneas celulares son la formación de cuerpos de inclusión (plomo y cromo), fuerte vacuolización, condensación mitocondrial (para todos los elementos) y células con un alto grado de degeneración o necrosadas cuando son tratadas con cadmio o selenio. Todas las concentraciones empleadas salvo para el cromo en AML12 (no se observan diferencias significativas) y la concentración media de adultos para el cadmio (se produce un aumento significativo) producen la disminución de las unidades de fluorescencia (DCFH-DA) debido a la destrucción del material genético y la incapacidad de la célula para producir ROS, por lo que en este ensayo, los valores obtenidos sugieren un papel de ROS como indicador de mortalidad más que de toxicidad. Determinadas concentraciones de cadmio y selenio encontradas en hígado y riñón de las tres especies de pingüino, producen la sobreexpresión de genes relacionados con la protección y el estrés celular. Los resultados obtenidos evidencian el posible riesgo toxicológico que la contaminación en la Antártida puede provocar a nivel celular sobre las poblaciones de Pygoscelis antarctica,

Pygoscelis papua y Pygoscelis adeliae en hígado y riñón. Summary Global and local contamination may be affecting one of the last pristine regions in the world, the Antarctica. Previous studies realized by our research group detected different concentrations of metals in different tissues of three species of penguin located in Antarctic Peninsula and associated islands (Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua and Pygoscelis adeliae), considered as key species in monitor such contaminants. In this Thesis we carried out the in vitro evaluation of the effects caused by such concentrations of cadmium, lead, chromium and selenium in two different cell lines: VERO, kidney cells and AML12, hepatic cells. Basal cytotoxicity and the responses associated to that exposition through the study of its effect on cellular viability, structural and ultrastructural changes, modifications on the cell cycle, type of predominant cell death and the cellular stress through the gene expression of genes related with metals toxicity (methallotioneins), cell stress (Heat-Shock proteins), oxidative stress (catalase) and apoptosis (bax) was studied. In order to evaluate the cell viability, a colorimetric technique was used, MTT through spectrophotometry. We evaluated the effect in cell cycle and the type of cell death using the reactive IP and IP/annexin respectively through Flow Cytometry. Structural and microstructural changes were observed by optic and electronic microscopy and cell stress was evaluated by the probe DCFHA-DA also by Flow Cytometry. Finally, gene expression study was carried out by qPCR. Cell viability assay using MTT shows that the mean concentration found in adult animals for cadmium is not compatible with cell viability in VERO cell line and we had only 2% of viability on AML12. None concentration studied of lead affected strongly to the cell viability; chromium affected with a percentage higher than 70%, this viability decreases in a remarkable way at the mean concentration found in juveniles animals in VERO cells. Selenium affected cell viability dramatically, with a percentage of living cells never higher than 4%. Data obtained about the effects caused on the different parts of the cell cycle show that cadmium causes a descent in G0/G1 and an increase in S phase for VERO cells, in the same way as higher concentrations studied in AML12, CE50 for lead, higher concentrations of selenium and every concentration of chromium. Meanwhile, lower concentrations of cadmium in AML12 (Ce50, juvenile and chicks) produced an increase of phase G0/G1 and lower concentrations of lead an increase of G2/M. More than 50% of cells were in apoptosis or necrosis for VERO cells treated at juvenile and adults concentrations for cadmium. Same result was found for AML12 cells treated with mean concentration found adults for cadmium, CE50 of lead, mean concentration found in chicks for chromium and mean concentration of adult, juvenile and chick of selenium. Morphological study showed that the most characteristic aspects observed in both cell lines are the inclusion bodies (lead and chromium), strong vacuolization and mithocondral condensation (every element studied) and a high degree of cell degeneration after treatment with cadmium and selenium. Every concentration used, except for the chromium in AML12 cells (no significant differences were observed) and mean adult concentration of cadmium (a significant increase was determined), cause a descent in fluorescence units (DCFH-DA) as a consequence of the destruction of genetic material and the inability of the cell for producing ROS, so in this assay obtained values suggest a role of ROS as indicators of mortality more than toxicity. Certain concentrations of cadmium and selenium found in liver and kidney of the three species of penguins, produced an overexpression of genes related with cell protection and stress. Results obtained in this Thesis, show the possible toxicological risk that the Antarctic contamination may cause at a cellular level in liver and kidney on population of Pygoscelis antarctica, Pygoscelis papua and Pygoscelis adeliae.