Direct Label-free Surface-Enhanced Raman Scattering Analysis of Nucleic Acids

Author

Morlà Folch, Judit

Director

Pazos Pérez, Nicolás Carlos

Alvarez Puebla, Ramón Angel

Guerrini, Luca

Date of defense

2017-06-08

Pages

220 p.



Department/Institute

Universitat Rovira i Virgili. Departament d'Enginyeria Química

Abstract

La recerca s'ha realitzat en el context de l'espectroscòpia “Surface-Enhanced Raman Scattering” (SERS) per a l'anàlisi d'àcids nucleics. SERS és una tècnica analítica de gran abast que combina l'especificitat estructural i alta flexibilitat experimental de l'espectroscòpia Raman amb l'extremada sensibilitat proporcionada per l'amplificació del senyal òptic per part de la nanoestructura metàl•lica. La caracterització dels àcids nucleics (ANs) s'ha convertit en una meta important en molts camps. En general, els ANs es troben en baixes quantitats de manera que la sensibilitat representa un requisit clau per a la seva detecció. En aquest sentit, l'espectroscòpia SERS es pot considerar una poderosa eina per a l'anàlisi de ANs, donat a la seva extraordinària sensibilitat i a la rica informació estructural proporcionada. Fins ara, l'anàlisi SERS de ANs ha estat en gran part restringit a enfocaments indirectes, perdent les informacions estructurals de l'adquisició directa de la petjada vibracional. En aquest sentit, nanopartícules de plata carregades positivament recobertes amb espermina, van ser dissenyades específicament per a l'anàlisi de ANs amb SERS directe. Mitjançant l'ús d'aquest substrat s'assegura la interacció electrostàtica entre els ANs i els col•loides produint espectres SERS intensos i altament reproduïbles a nivell ultrasensible. Aquest mètode directe, sense necessitat d'afegir marcadors i altament sensible es va implementar amb èxit en diverses aplicacions d'interès biològic, incloent la identificació i quantificació de nucleobases amb modificacions, en simple i doble cadenes d'ADN, quantificació de la composició de nucleobases en ADN curts i en ADN genomic, i classificació vibracional de ARNs petits estructuralment similars. En resum, aquesta tesi demostra el gran potencial analític d'aquest nou mètode directe, obrint noves vies pel futur desenvolupament d'una tècnica analítica ràpida, de baix cost i alt rendiment per l’anàlisi d'àcids nucleics.


La investigación se ha realizado en el contexto de la espectroscopia “Surface-Enhanced Raman Scattering” (SERS) para el análisis de ácidos nucleicos. SERS es una técnica analítica de gran alcance que combina la especificidad estructural y alta flexibilidad experimental de la espectroscopia Raman con la extremada sensibilidad proporcionada por la amplificación de la señal óptica por parte de la nanoestructura metálica. La caracterización de los ácidos nucleicos (ANs) se ha convertido en una meta importante en muchos campos. En general, los ANs se encuentran en bajas cantidades de modo que la sensibilidad representa un requisito clave para su detección. En este sentido, la espectroscopia SERS se puede considerar una poderosa herramienta para el análisis de ANs, dado a su extraordinaria sensibilidad y la rica información estructural proporcionada. Hasta ahora, el análisis SERS de ANs ha sido en gran parte restringido a enfoques indirectos, perdiendo las informaciones estructurales de la adquisición directa de la huella vibracional. En este sentido, nanopartículas de plata cargadas positivamente recubiertas con espermina, fueron diseñadas específicamente para el análisis de ANs con SERS directo. Mediante el uso de este sustrato se asegura la interacción electrostática entre los ANs y los coloides produciendo espectros SERS intensos y altamente reproducibles a nivel ultrasensible. Este método directo, sin necesidad de añadir marcadores y altamente sensible se implementó con éxito en diversas aplicaciones de interés biológico, incluyendo la identificación y cuantificación de nucleobases modificadas, en simple y doble cadena de ADN, cuantificación de la composición de nucleobases en ADN cortos y en el ADN genómico, y clasificación vibracional de ARNs pequeños estructuralmente similares. En resumen, esta tesis demuestra el gran potencial analítico de este nuevo método directo, abriendo nuevas vías para el futuro desarrollo de una técnica analítica rápida, de bajo coste y alto rendimiento para análisis de ácidos nucleicos.


The research has been carried out in the context of Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) spectroscopy for nucleic acids analysis. SERS is a powerful analytical technique that combines the structural specificity and high experimental flexibility of Raman spectroscopy with the extremely high sensitivity provided by the metal nanostructure amplification of the optical signal. Characterization of nucleic acids (NAs) has become a major goal in fields such as genetics or drug discovery. NAs are usually found in low amounts which require extremely sensitive techniques to be detected. Sensitivity represents a key requirement for their implementation into easy-to-use, cost-effective, rapid and high accuracy NA sensors. In this regard, the extraordinary sensitivity, in combination with the rich structural information provided by the Raman spectra, turned SERS into a powerful tool for the analysis of NAs. SERS analysis of NAs has been largely restricted to indirect approaches, dismissing the exquisite structural information provided by the direct acquisition of the biomolecular vibrational fingerprint. In this regard, positively charged silver nanoparticles coated with spermine were specifically designed for direct label-free SERS analysis of nucleic acids. By using these cationic nanoparticles the electrostatic interaction between NAs and the colloids is ensured yielding intense and highly reproducible SERS spectra at the ultrasensitive level. This highly sensitive label-free approach was successfully implemented in various applications of biological interest including identification and quantification of chemically-modified nucleobases in single and double stranded DNA, quantification of nucleobase composition in short and genomic DNA, and vibrational classification of structurally similar small RNA. In summary, this thesis demonstrates the tremendous analytical potential of this novel direct SERS method for nucleic acids analysis, opening new ways for the future development of a fast, low-cost, and high-throughput analytical technique for nucleic acids analysis.

Keywords

Nanoparticules; SERS; Mutacions al ADN; Nanoparticulas; Mutaciones en el ADN; DNA mutations

Subjects

535 - Optics; 544 - Physical chemistry; 577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics; 6 - Applied Sciences. Medicine. Technology

Knowledge Area

Ciències

Documents

TESI.pdf

12.51Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)