Estudi de la dinàmica del microambient tumoral en l’adquisició de resistència als inhibidors de BRAF en melanoma. Identificació de biomarcadors d’aplicació clínica

Abstract

El melanoma és un dels tumors humans més agressius que sorgeix de la proliferació incontrolada de melanòcits. Tot i molts avenços importants, el desenvolupament de resistències continua sent un obstacle significatiu per a la curació del melanoma. Un dels components clau de la resistència és la inflamació associada al càncer que promou la tumorigénesis a molts nivells. Hi ha evidències que indiquen que el manteniment, la progressió i la resistència al tractament dels tumors estan determinats per components del microambient tumoral (TME). Així, atacar els components del TME pot tenir un impacte terapèutic en el tractament del melanoma. A la primera part d'aquest estudi, observem que el secretoma de les cèl·lules de melanoma resistents a l'inhibidor de BRAF (BRAFi) era ric en citocines pro–tumorals. Més concretament, descrivim que la secreció de M–CSF era essencial per induir un fenotip resistent a Vemurafenib (BRAFi) a les cèl·lules de melanoma. A més, demostrem que el mAb de M–CSF en combinació amb Vemurafenib i un bloquejador de l'autofàgia indueixen sinèrgicament l'apoptosi, dificulten la migració i redueixen el creixement tumoral en cèl·lules de melanoma resistents a BRAFi. Traslladant aquestes troballes in vitro i in vivo a la cohort de pacients, vam demostrar que uns nivells plasmàtics més baixos de M–CSF s'associaven a un millor pronòstic en pacients amb melanoma metastàtic, cosa que suggereix que el M–CSF podria ser una diana terapèutica prometedora per als melanomes resistents a BRAFi. A la segona part de l'estudi, per explorar més a fons els canvis al TME, vam decidir estudiar l'infiltrat inflamatori de les cèl·lules parentals i resistents a Vemurafenib utilitzant un model singènic de ratolí. Els resultats de la citometria de flux van revelar que els tumors resistents i els tumors que no responien a Vemurafenib presentaven una infiltració de cèl·lules immunitàries més immunosupressora en comparació dels tumors parentals i els que responien al tractament amb Vemurafenib, respectivament. A més, els resultats mostren que els monòcits tractats amb medis condicionats (CM) resistents promouen la diferenciació en macròfags associats a tumors (TAMs) amb fenotip immunosupressor (M2). A més, observem que el CM de línies cel·lulars de melanoma resistents promou una activació de CAFs amb fenotips plàstics mixts. D'acord amb la primera part de l'estudi, observem un augment dels nivells plasmàtics de M–CSF en el model de ratolins singènics resistents. A causa d'aquest fet, l'administració de mAb anti-M–CSF en monoteràpia va ser capaç de disminuir significativament l'infiltrat monocític. D'altra banda, el tractament combinat de mAb anti-M–CSF amb Vemurafenib va disminuir la població infiltrada pro–tumoral. Finalment, els tumors de melanoma doblement resistents (mAb anti-M–CSF + Vemurafenib) presenten una disminució de TAMs immunosupressors però un augment de MDSCs. Traslladant aquestes troballes in vitro i in vivo a una cohort de pacients, utilitzant IHC múltiplex i patologia digital, validem els nostres resultats previs per analitzar i fenotipar l'infiltrat immune en biòpsies de melanoma i el seu valor pronòstic. En resum, el nostre estudi proporciona una informació nova i rellevant des del punt de vista pronòstic, obrint vies per a tractaments personalitzats centrats en la modulació del TME i utilitzant el secretoma com a eina diagnòstica per monitoritzar la progressió de la malaltia en l'adquisició de resistència a BRAFi en melanomes.

El melanoma es uno de los tumores humanos más agresivos que surge de la proliferación incontrolada de melanocitos. A pesar de muchos avances importantes, el desarrollo de resistencias sigue siendo un obstáculo significativo para la curación del melanoma. Uno de los componentes clave de la resistencia es la inflamación asociada al cáncer que promueve la tumorigénesis a muchos niveles. Hay evidencias que indican que el mantenimiento, la progresión y la resistencia al tratamiento del tumor están determinados por componentes del microambiente tumoral (TME). Así pues, atacar los componentes del TME puede tener un impacto terapéutico en el tratamiento del melanoma. En la primera parte de este estudio, observamos que el secretoma de las células de melanoma resistentes al inhibidor de BRAF (BRAFi) era rico en citocinas pro–tumorales. Más concretamente, describimos que la secreción de M–CSF era esencial para inducir un fenotipo resistente a Vemurafenib (BRAFi) en las células de melanoma. Además, demostramos que el mAb de M–CSF en combinación con Vemurafenib y un bloqueador de la autofàgia inducen sinérgicamente la apoptosis, dificultan la migración y reducen el crecimiento tumoral en células de melanoma resistentes a BRAFi. Trasladando estos hallazgos in vitro e in vivo a la cohorte de pacientes, demostramos que unos niveles plasmáticos más bajos de M–CSF se asociaban a un mejor pronóstico en pacientes con melanoma metastásico, lo que sugiere que el M–CSF podría ser una diana terapéutica prometedora para los melanomas resistentes a BRAFi. En la segunda parte del estudio, para explorar más a fondo los cambios en el TME, decidimos estudiar el infiltrado inflamatorio de las células parentales y resistentes utilizando un modelo de ratón singénico. Los resultados de la citometría de flujo revelaron que los tumores resistentes y los tumores que no respondían a Vemurafenib presentaban una infiltración de células inmunitarias más inmunosupresora en comparación con los tumores parentales y los que respondían a Vemurafenib, respectivamente. Además, los resultados muestran que los monocitos tratados con medios condicionados (CM) resistentes promueven la diferenciación en macrófagos asociados a tumores (TAMs) con fenotipo inmunosupresor (M2). Además, observamos que el CM de líneas celulares de melanoma resistentes promueve una activación de CAFs con fenotipos plásticos mixtos. En consonancia con la primera parte del estudio, observamos un aumento de los niveles plasmáticos de M–CSF en el modelo de ratones singénicos resistentes. Debido a este hecho, la administración de mAb anti-M–CSF en monoterapia fue capaz de disminuir significativamente el infiltrado monocítico. Por otro lado, el tratamiento combinado de mAb anti-M–CSF con Vemurafenib, disminuyó la población infiltrada pro–tumoral. Finalmente, los tumores de melanoma doblemente resistentes (mAb anti-M–CSF + Vemurafenib) presentan una disminución de TAMs inmunosupresores pero un aumento de MDSCs. Trasladando estos hallazgos in vitro e in vivo a la cohorte de pacientes, utilizando IHC multiplex y patología digital, validamos nuestros resultados previos para analizar y fenotipar el infiltrado inmune en biopsias de melanoma y su valor pronóstico. En resumen, nuestro estudio proporciona una información novedosa y relevante desde el punto de vista pronóstico, abriendo vías para tratamientos personalizados centrados en la modulación del TME y utilizando el secretoma como herramienta diagnóstica para monitorizar la progresión de la enfermedad en la adquisición de resistencia a BRAFi en melanomas.

Melanoma is one of the most aggressive human tumours that arises from the uncontrolled proliferation of melanocytes. Despite many important advances, development of resistance remains a significant obstacle to melanoma curability. One of the key components of the resistance is the cancer–associated inflammation that promotes tumorigenesis at many levels. Accumulated evidence indicates that tumor maintenance, progression, and treatment resistance are determined by components of the tumor microenvironment (TME). Thus, targeting the components of the TME may have a therapeutic impact on melanoma treatment. In the first part of this study, we observed that BRAF inhibitor (BRAFi)–resistant melanoma cells secretome was rich in pro–tumour cytokines. More specifically, we described that M–CSF secretion was essential to induce a Vemurafenib (BRAFi)–resistant phenotype in melanoma cells. Further, we demonstrated that M–CSF mAb in combination with Vemurafenib and autophagy blocker synergistically induce apoptosis, impair migration and reduce tumour growth in BRAFi–resistant melanoma cells. Translating these in vitro and in vivo findings to the patient cohort, we demonstrated that lower M–CSF plasma levels were associated with better prognosis in metastatic melanoma patients, suggesting that M–CSF could be a promising therapeutic target toward BRAFi–resistant melanomas. In the second part of the study, to further explore the changes in the TME, we decided to study the inflammatory infiltrate of the parental and resistant cells using a syngeneic mouse model. Flow cytometry results revealed that resistant tumours and tumors that do not respond to Vemurafenib (BRAFi) had a more immunosuppressive immune cell infiltration compared to the parental tumours and Vemurafenib responders, respectively. Furthermore, results show that monocyte treated with resistant conditioned media (CM) promote differentiation into tumor associated macrophages (TAMs) with immunosuppressive phenotype (M2). In addition, we observe that the CM of resistant melanoma cell lines promotes a CAFs activation with mixed plastic phenotypes. In line with the first part of the study, we observe an increase of M–CSF plasmatic levels in resistant syngeneic mice model. Due to this fact, administration of anti-M–CSF mAb in monotherapy was able to significantly decrease the monocytic infiltrate. On the other hand, combined treatment of anti-M–CSF mAb with Vemurafenib, decrease the pro–tumoral infiltrated population. Finally, doble resistant melanoma tumors (anti-M–CSF mAb + Vemurafenib) have a decrease in immunosuppressive TAMs but an increase in MDSCs. Translating these in vitro and in vivo findings to the patient cohort, using multiplex IHC and digital pathology, we validate our previous results to analysed and phenotype the immune infiltrate in melanoma biopsies and their prognostic value. In summary, our study provides a novel and prognostically relevant information, opening avenues for personalized treatments focused on modulating the TME and using the secretome as a diagnostic tool to monitor disease progression in BRAFi resistant acquisition in melanomas.