Criopreservación espermática en la especie porcina : optimización de la técnica

Abstract

La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación.

Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.