Regulation of coagulation factors by microRNAs : role in interindividual variability and implications for hemostatic disorders= Regulación de los factores de la coagulación a través de microRNA: papel en la variabilidad interindividual y su implicación en trastornos hemostáticos

Abstract

En esta tesis, se estudiaron tres aspectos relacionados con el campo de la hemostasia y se presentan en tres capítulos independientes con un nexo común; el papel de los miRNA como nuevos reguladores del sistema hemostático. Objetivos: 1) Evaluar la regulación de FXI por miRNA en hígado humano. 2) Identificar SNP en el 3'UTR de factores de coagulación que desestabilicen la unión de miRNA con consecuencias en los niveles plasmáticos y riesgo de sufrir trombosis. 3) Estudiar el papel indirecto de miRNA sobre la regulación de las proteínas hemostáticas a través de HNF4α. Métodos: Se realizaron microarrays y búsquedas in silico de miRNAs. Líneas celulares humanas, cultivo primario de hepatocitos murinos se emplearon para transfecciones y ensayos de luciferasa. Correlaciones entre los niveles de expresión de miRNAs y mRNAs se realizaron en muestras de hígados. Se incluyeron sujetos de los estudios MEGA y LETS. Para la identificación de variantes en el 3'UTR, se seleccionaron los sujetos con niveles extremos para su secuenciación y genotipado. Resultados: 1. MiR-181a-5p regula la expresión de FXI Predicciones in silico identifican cuatro miRNA como potenciales candidatos a regular la expresión de FXI. Sólo miR-181a-5p redujo los niveles de mRNA y proteína de FXI, y el anti-miR-181-5p aumentó los niveles de mRNA y proteína de FXI en células hepáticas. Los ensayos de luciferasa demostraron una interacción directa entre miR-181-5p y el 3’UTR de F11. En hígados humanos sanos se mostró una correlación inversa y significativa entre los niveles de mRNA de F11 y de miR-181a-5p. 2. Identificación de una variante en el 3’UTR del F11 potencialmente regulada por miRNA En dos estudios caso-control, se secuenciaron los 3'UTR de 9 genes hemostáticos en sujetos con niveles plasmáticos extremos. Se identificaron 26 variantes, 4 de ellas con diferencias significativas entre los grupos de los extremos [F2: rs1799963 (previamente descrita) y F11: rs4253429, rs4253430 y rs1062547]. Los SNP de F11 mostraron un alto desequilibrio de ligamiento con las variantes funcionales descritas rs2289252 y rs2036914. El análisis en controles con el alelo silvestre para estas variantes conocidas de F11 mostró que rs1062547 y rs4253430 se asociaban con un aumento significativo de la actividad FXI. Se evaluaron aquellos SNP que pudieran perturbar la unión de miRNA in silico e in vitro. La predicción in silico reveló que la presencia de estos SNP podrían interferir en la unión de 2 miRNA (rs1062547 con miR-513a-5p y rs4253430 con miR-544). Los ensayos de luciferasa mostraron que sólo miR-544 disminuía significativamente su actividad. Dicha inhibición no se observó cuando se utilizó un vector mutado con rs4253430. 3. MiR-24 y miR-34a regulan la expresión de proteínas hemostáticas a través de HNF4α Se encontraron correlaciones positivas y muy significativas entre los niveles de expresión de HNF4A y dianas hepáticas de la coagulación. Los hígados con niveles extremos de miRNA mostraron asociaciones inversas con los niveles de expresión de factores de coagulación. Estos resultados sugieren que las diferencias en la expresión de mRNA de HNF4A pueden explicar, en parte, las variaciones individuales observadas en la expresión de factores de coagulación en el hígado humano. MiR-24 y miR-34a se unen a varios sitios en HNF4A humano. MiR-24 y miR-34a redujo los niveles diferentes proteínas hemostaticas en HepG2. En tejido hepático sano se observaron correlaciones negativas entre los niveles de HNF4A, miR-24 y miR-34a. Además, miR-24 y miR-34a redujeron los niveles del HNF4α y los niveles de expresión de diferentes proteínas hemostáticas en hepatocitos murinos. Conclusiones: Aproximaciones in silico, in vitro y ex vivo, han mostrado que ciertos miRNA funcionan como reguladores de la expresión de diversos factores hemostáticos. Las consecuencias patológicas de estas regulaciones quedan por ser exploradas.

In the present Thesis, I have addressed three points of investigation in the thrombosis field that have been reported as independent Chapters with a common nexus, the role of miRNAs as new regulators of the hemostatic system. Aims: 1) To investigate the potential relevance of miRNAs as new elements that may modulate FXI in human liver. 2) To identify 3’UTR variants in coagulation genes that influence coagulation factor levels and deep vein thrombosis risk through miRNA modulation. 3) To gain a deeper insight into the physiological modulator role of miRNAs in the expression of coagulation factors regulated by HNF4α. Methods: Microarray and in silico search of miRNAs were performed. Human cell lines and Murine hepatocyte primary culture were used for transfections (in vitro validation). Luciferase assays were used. Ex vivo correlations between miRNAs and mRNAs expression levels were performed in liver samples. Study subjects from MEGA and LETS studies were included. For the identification of 3’UTR variants, we selected subjects with extreme levels. Sequencing and genotyping were performed in 3’UTR of hemostatic factors genes. Results: 1. MiR-181a-5p regulates FXI expression in human liver In silico predictions suggest that 4 miRNAs may bind to F11 mRNA. However, only miR-181a-5p inhibits FXI by decreasing levels of both F11 mRNA and protein expression, anti-miR-181-5p increased both mRNA and protein levels of FXI in human. The expression of F11 mRNA in human liver is inversely correlated with the expression of miR-181a-5p, demonstrating for the first time that F11 expression may be regulated by miRNAs. This new regulatory mechanism of F11 expression could partially explain the interindividual variability of plasma FXI found in population. 2. Identification of a variant in the F11 3'UTR potentially regulated by miRNA In two case-control studies, 3’ UTRs of selected coagulation factor genes were sequenced. Four (in F2 and F11) of the 28 variants identified, were clearly more prevalent in low than high levels. F11 SNPs were in partial, inverse linkage (0.4 ≤r2<0.5) with functional variants rs2289252 & rs2036914 previously described. In wildtype carriers of the known variants, rs1062547 and rs4253430 were associated with plasma F11 activity, but none of the variants were associated with venous thrombosis risk. In silico prediction revealed that certain SNPs might disturb the binding sites of miRNAs. In vitro data, confirmed that only miR-544 showed a significant decrease of the luciferase activity in comparison with a scrambled control. This inhibition was not observed when using a mutated vector with rs4253430. 3. MiR-24 and miR-34a regulate several hemostatic proteins expression through HNF4α modulation In human healthy livers we observed significant and positive correlations between expression levels of both HNF4A and several hemostatic proteins. In samples with extreme levels of miR-24 and miR34a, we observed that HNF4A and hemostatic factors transcript levels were inversely correlated. Variations in the expression of these miRNAs could partly explain differences of HNF4A expression levels and therefore levels of several hemostatic factors in healthy subjects. MiR-24 and miR-34a bind to several sites on human HNF4A. In HepG2 cells, miR-24 transfections reduced expression levels of F10, F12, PROC, and PROS1, these latter were also reduced with miR-34a as well asSERPINC1 and PROZ transcript levels. HNF4A transcripts levels were negatively correlated with miR-24 and miR-34a levels in human healthy livers. In murine hepatocytes, miR-24 and miR-34a transfections reduced HNF4α levels and the expression levels of various hemostatic proteins. Conclusions: The present thesis identifies diverse mechanisms implicating miRNAs in the control of hemostasis. Further studies will help in linking these gene-silencing processes with pathologic processes as well as translating them into practical application.