Contribució de BRCA1 i 53BP1 a la reparació dels trencaments del DNA: efecte de l’edat

Abstract

Els organismes han desenvolupat mecanismes eficients per reparar les lesions que es generen constantment al DNA. No obstant això, la freqüència d’anomalies potencialment oncogèniques, com ara els trencaments de doble cadena (DSBs; Double-Strand Breaks) o les reorganitzacions cromosòmiques, es veu incrementada en les persones de més edat. Alguns autors apunten a que l’acumulació de lesions al DNA amb l’edat podria estar relacionada amb una deficiència en el funcionament de les vies de reparació dels DSBs. Tanmateix, la falta d’evidències que estableixin una causalitat directa i la desconeixença del mecanisme molecular associat han dificultat arribar a una conclusió al respecte. En aquesta tesi s’ha comparat l’eficiència de reparació dels DSBs en cèl·lules epitelials mamàries humanes (HMECs; Human Mammary Epithelial Cells) provinents de teixits no tumorals de donants joves (<27 anys) i grans (>60 anys). En primer lloc s'ha mesurat la cinètica d'inducció i reparació dels DSBs mitjançant la quantificació del nombre de foci de H2AX després d'irradiar les cèl·lules. Les cèl·lules de donants grans van presentar una freqüència basal de foci de H2AX superior a la de les joves, i un major nombre de foci a tots els temps post-irradiació analitzats (1h, 2h i 24h). La modelització matemàtica de les dades obtingudes va permetre concloure que les cèl·lules derivades de donants joves i grans reparaven els DSBs a una velocitat similar, però que aquestes últimes presentaven un retard en l’inici de la reparació dels DSBs. Per tal d'aprofundir en el mecanisme responsable d’aquest retard en l’inici de la reparació en les HMECs de donants grans, s’ha avaluat l'activitat de les dues vies principals de reparació dels DSBs: la HR (Homologous Recombination) i la c-NHEJ (canonical Non-Homologous End-Joining). Les HMECs es van transfectar amb uns plàsmids reporters específicament dissenyats per mesurar l’eficiència d’aquestes vies. Les cèl·lules de donants grans van presentar una disminució en l’activitat, tant de la c-NHEJ com de la HR. Mitjançant l’assaig de western blot es va descartar que aquesta disminució fos deguda a una reducció en la quantitat de les principals proteïnes implicades. A continuació, es va analitzar l’eficiència del reclutament de les proteïnes involucrades en la tria de la via de reparació del DSBs: BRCA1 i 53BP1, responsables de dirigir la reparació cap a la via de la HR i de la c-NHEJ, respectivament. Es va analitzar el reclutament de BRCA1 als DSBs en cèl·lules CENPF positives, ja que la HR només és activa durant les fases S/G2, i no es van observar diferències relacionades amb l’edat de les donants. En mesurar el reclutament de 53BP1 als DSBs, al llarg de tota la interfase, les cèl·lules provinents de donants grans van presentar una reducció significativa en el reclutament de 53BP1 als DSBs radioinduïts. L’absència de 53BP1 en aquestes cèl·lules afavoreix la formació ectòpica de foci de BRCA1, CtIP i RPA a la fase G1, indicant que alguns dels DSBs estant patint una resecció extensa. Aquest fenomen és especialment perillós en aquesta fase del cicle perquè els trencaments processats no podran ser dirigits a la HR i, en canvi, seran probablement reparats per vies de reparació alternatives que són altament mutagèniques. En definitiva, el reclutament deficient de 53BP1 en HMECs provinents de donants d’edat avançada comporta una disminució en la reparació dels DSBs per la c-NHEJ i permet el reclutament de BRCA1 i la resecció dels extrems trencats del DNA a la fase G1 per vies alternatives a la c-NHEJ. Això es tradueix en un retard en l’inici de la reparació dels DSBs que probablement promou la formació de reorganitzacions cromosòmiques potencialment oncogèniques.

Organisms have developed mechanisms to efficiently repair the lesions that are continuously induced in their DNA. However, it has been described an increased frequency of potentially oncogenic abnormalities, such as DNA double-strand breaks (DSBs) and genome rearrangements, in older individuals. Related to this, some authors have pointed out that a deficiency in the DNA repair mechanisms could be responsible for the observed accumulation of DNA damage with age. Nonetheless, direct causality remains elusive and lack of knowledge of the molecular mechanisms underlying the age-associated repair defect makes it difficult to draw conclusions. In this thesis, the efficiency of DSB repair has been analyzed in Human Mammary Epithelial Cells (HMECs) derived from non-tumoral tissues from young (<27 years old) and aged (>60 years old) donors. First, the kinetics of DSB induction and repair have been evaluated by quantifying the number of H2AX foci after irradiation. Cells from aged donors showed an increased basal frequency of H2AX foci, and the number of H2AX foci was higher than in young donors’ cells at all times after irradiation analyzed (1h, 2h and 24h). Mathematical modelling of the data obtained allowed us to conclude that although the speed of DSB repair is similar for aged and young donors, the former elicit a delay in the firing of the DSB repair mechanisms. In order to explore the mechanisms underlying the delay in DSB repair firing in HMECs from aged donors, the activity of the two main DSB repair pathways -the HR (Homologous Recombination) and the c-NHEJ (canonical Non-Homologous End-Joining)- has been evaluated. To do so, HMECs were transfected with reporter plasmids that are specifically designed to measure the efficiency of these two repair pathways. Cells from aged donors showed a decreased efficiency of both c-NHEJ and HR. Western blot analysis discarded that this decrease was related to reduced levels of the main proteins involved in DSB repair. Next, we analyzed the recruitment efficiency of the proteins involved in DSB repair pathway choice: BRCA1 and 53BP1, primary responsible to direct the repair to the HR and the c-NHEJ, respectively. Because the HR is only active during S/G2 phases, analysis of the recruitment of BRCA1 to DSBs was restricted to CENPF positive cells, and showed no age-associated differences. Instead, 53BP1 recruitment to DSBs was analyzed during the whole interphase and cells from aged donors showed a significant reduction in the recruitment of 53BP1 to radiation-induced DSBs. Absence of 53BP1 favoured the ectopic formation of BRCA1, CtIP and RPA foci, indicating that a fraction of the DSBs in G1 cells from aged donors suffer an extensive end resection. This entails a considerable threat, because the repair of these extensively processed DNA breaks during G1 can no longer be directed to the c-NHEJ nor to the HR repair. Instead, these DSBs would probably be repaired by highly mutagenic alternative pathways. In conclusion, the deficient recruitment of 53BP1 in HMECs from aged donors leads to a decreased repair by the c-NHEJ. Also, it permits the recruitment of BRCA1 to some DSBs while in G1, that results in extensive DNA end resection. Thus, repair of these DSBs must be accomplished by alternative mechanisms other than c-NHEJ. This is translated into a delayed initiation of DSB repair which in turn, probably promotes the generation of potentially oncogenic genome rearrangements with age.