Gene therapy targeting neuregulins for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis

Abstract

L’esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia neurodegenerativa devastadora sense cap tractament efectiu disponible. Els mecanismes moleculars involucrats en la mort de les motoneurones (MN) són complexos i inclouen nombroses disfuncions d’aquestes, on les cèl·lules del voltant com els astròcits i la micròglia hi poden contribuir. La Neuregulina 1 (NRG1) és un factor neurotròfic expressat en les MNs i les unions neuromusculars que ajuda en el desenvolupament neuromuscular i axonal i en el seu manteniment. Estudis recens suggereixen un rol crucial de la NRG1 i dels seus receptors ErbB en l’ELA, particularment per la isoforma I (NRG1-I) en el procés de reinnervació colateral, i per la isoforma III (NRG1-III) en la preservació de les MNs, obrint un nou camp per desenvolupar noves teràpies per l’ELA. Tanmateix, per clarificar el rol de la via NRG1-ErbB en la supervivència de les MNs és necessari fer més estudis i així provar la seva eficàcia terapèutica. En la present tesis, hem avaluat l’efecte terapèutic de la sobreexpressió de la NRG1 en el sistema nerviós central i perifèric. D’aquesta manera, primer van caracteritzar el rol de la NRG1 exògena utilitzant un model in vitro de cultius organotípics de medul·la espinal subjectes a una excitotoxicitat crònica causada per l’àcid DL-threo-β-hydroxaspàrtic. Els nostres resultats mostren que l’addició en el medi de la NRG1 recombinant humana (rhNRG1) va incrementar significativament la supervivència de les MNs a través de l’activació dels receptors ErbB. Aquest efecte va ser bloquejat quan vam afegir el lapatinib, un inhibidor dels ErbB. El tractament amb la rhNRG1 també va reduir la reactivitat microglial superant els efectes causats per l’excitotoxicitat, i va activar la via de supervivència PI3K/AKT, a més de restaurar el flux autofàgic normal en el cultiu. A més a més l’addició de la rhNRG1 al medi va promoure el creixement neurític motor i sensorial. A continuació vàrem decidir d’utilitzar teràpies gèniques basades en vectors adeno-associats per sobreexpressar la NRG1-I en el múscul esquelètic, i la NRG1-III en la medul·la espinal per preservar les MNs en un model in vivo d’ELA, els ratolins SOD1G93A. Els resultats obtinguts van indicar que ambdues teràpies gèniques van ser capaces de preservar la funció neuromuscular dels músculs de les extremitats, van millorar la locomoció, van incrementar el nombre de MNs supervivents, i van reduir la reactivitat astrocitària i microglial en les femelles SOD1G93A tractades a l’estadi final de la malaltia. A més a més, en la medul·la espinal l’eix NRG1-III/ErbB4 regula l’excitabilitat de la MN a través del transportador KCC2 i redueix l’expressió del marcador de vulnerabilitat de MN MMP-9. La NRG1-I expressada en el múscul esquelètic va senyalitzar amb els receptors ErbB2 i 3 presents en les cèl·lules de Schwann terminals, per promoure reinnervació axonal. Malgrat això, quan vàrem combinar ambdues teràpies gèniques no vam trobar un efecte sinèrgic. Conjuntament, els nostres resultats indiquen que les isoformes de la NRG1 juguen un rol important en la supervivència de les MN i que la sobreexpressió viral pot ser considerada com una nova teràpia per tractar l’ELA.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a devastating neurodegenerative disorder with no effective treatment currently available. The molecular mechanisms that are involved in the motoneuron (MN) death are complex and include several MN dysfunctions, and contribution of surrounding cells such as microglia and astrocytes. Neuregulin 1 (NRG1) is a neurotrophic factor highly expressed in MNs and neuromuscular junctions that supports axonal and neuromuscular development and maintenance. Recent studies have suggested a crucial role for NRG1 and their ErbB receptors in ALS, particularly for isoform I (NRG1-I) in the collateral reinnervation process, and isoform III (NRG1-III) in the preservation of the MNs, opening a new window for developing novel ALS therapies. However, further studies are needed to clarify the role of the NRG1-ErbB pathway on MN survival and to provide the proof of concept of its therapeutical efficacy. In the present thesis we have evaluated the therapeutic effect of NRG1 overexpression in the central and the peripheral nervous system. For this purpose, we first characterized the role of exogenous NRG1 using an in vitro model of spinal cord organotypic cultures (SCOC) subject to chronic excitotoxicity caused by DL-threo-β-hydroxyaspartic acid. Our results revealed that addition of recombinant human NRG1 (rhNRG1) to the medium significantly increased MN survival through the activation of ErbB receptors, which was blocked by addition of lapatinib, an ErbB inhibitor, and reduced microglial reactivity overcoming the excitotoxicity effects. rhNRG1 activated the pro-survival PI3K/AKT pathway and restored the autophagic flux in the spinal cord culture. Furthermore, addition of rhNRG1 to the medium promoted motor and sensory neurite outgrowth. We have then directed gene therapies based on adeno-associated viruses to overexpress NRG1-I in the skeletal muscles, and NRG1-III in the spinal cord to preserve the MNs in the in vivo model of ALS, the SOD1G93A mice. Our results indicate that both gene therapies were able to preserve the neuromuscular function of the hindlimb muscles, improve the locomotor performance, increase the number of surviving MNs and reduce the astrocyte and microglial reactivity in the treated female SOD1G93A mice at the end-stage of the disease. Furthermore, in the spinal cord the NRG1-III/ErbB4 axis regulates MN excitability through the KCC2 transporter and reduces the expression of the MN vulnerability marker MMP-9. NRG1-I expressed in the skeletal muscle signals with ErbB2 and 3 receptors present in terminal Schwann cells to promote axonal reinnervation. However, when we aimed to combine both viral-mediated therapies we did not find a synergic effect. Altogether, our results indicate that NRG1 isoforms play an important role on MN survival and that a viral-mediated overexpression may be considered as a potential novel therapy to treat ALS.