Unveiling the biological role of stigmasterol biosynthesis in tomato plants

Abstract

In plants, the sterol biosynthetic pathway leads to the production of a complex mixture of end-products, among which β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, and cholesterol are the most abundant ones. Stigmasterol, the end-product of the 24-ethyl sterol branch is synthesized from β-sitosterol by the action of sterol C22-desaturase (C22DES). Despite C22DES was identified about a decade ago, there is still a lack of knowledge about several relevant aspects related to the structure and function of this enzyme. Furthermore, several studies have reported the occurrence of changes in the stigmasterol to β-sitosterol ratio (STIG/SIT) during plant development and in their responses to environmental stimuli which have been related with the activity of C22DES. However, the biological relevance of the changes in stigmasterol levels is currently unknown. Based on this, the main objective of present work has been the elucidation of the role of stigmasterol during plant growth and development as well as in its response to environmental challenges. Tomato (Solanum lycopersicum cv. MicroTom) was selected for this studies taking advantage that is one of the few plants in which C22DES is encoded by a single-copy gene. The goals of this thesis have been: (1) the functional and structural characterization of C22DES in terms of subcellular localization and mechanism of action, and (2) the evaluation of the role of stigmasterol biosynthesis in tomato plant growth, development and in responses to biotic and abiotic stresses. The results obtained in this thesis have confirmed that C22DES is targeted and retained in the endoplasmic reticulum (ER)-membrane. C22DES consists of two well-differentiated domains: a single N-terminal transmembrane-helix domain (TMH1), which is sufficient for the ER-membrane targeting and retention, and a globular domain that also contacts with the ER-membrane. The globular domain may also interact and be retained in the ER in the absence of TMH1, but it is enzymatically inactive, revealing the requirement of the N-terminal membrane domain for enzyme activity. The in silico analysis of the TMH1 region revealed several features that could be involved in substrate recognition and binding. Transgenic tomato plants with altered STIG/SIT ratios have been generated by overexpression, amiRNA-mediated silencing, and knock-out of the C22DES gene. The obtained results have shown that lack of stigmasterol is not lethal for the plant since the C22des- knock-out plants are able to complete their life cycle. However, C22des- knock- out mutant showed several phenotypic abnormalities related to growth and developmental processes. The C22des- knock-out plants also show increased susceptibility to Botrytis cinerea infection. The data provided in this thesis contribute to expand the current knowledge on the mechanism of action of stigmasterol and C22DES in tomato plants and set the basis for further studies focused on unraveling the mechanisms involved in the regulation of C22DES activity. The C22des- knock-out mutant generated in this work also provides a unique and highly relevant tool to evaluate the role of stigmasterol in plants.

En plantas, la ruta de biosíntesis de los esteroles da lugar a la generación de una compleja mezcla de productos finales, entre los cuales, el β-sitosterol, estigmasterol, campesterol, colesterol son los más abundantes. El estigmasterol es el producto final en la rama de los 24-etil esteroles, y se sintetiza a partir del β-sitosterol por la acción de la enzima esterol C22-desaturasa (C22DES). A pesar de que C22DES fue identificada hace una década, aún hace falta mayor conocimiento acerca de algunos aspectos relevantes relacionados con la estructura y función de esta enzima. Además, algunos estudios han descrito la existencia de cambios en la relación estigmasterol a β-sitosterol (STIG/SIT) durante el desarrollo de la planta y su respuesta a estímulos ambientales, que se han relacionado con la actividad de C22DES. Sin embargo, aún se desconoce la relevancia biológica de los cambios en los niveles de estigmasterol. Basándonos en esto, el objetivo principal del presente trabajo ha sido el esclarecimiento del papel del estigmasterol durante el crecimiento de la planta y el desarrollo, así como en su respuesta a desafíos ambientales. Para este estudio se seleccionó el tomate (Solanum lycopersicum) como planta modelo aprovechando que es una de las pocas especies vegetales en las que C22DES está codificada por un gen de copia única. Los objetivos de esta tesis han sido: (1) la caracterización funcional y estructural de C22DES en términos de localización subcelular y mecanismo de acción, y (2) la evaluación del papel de la biosíntesis de estigmasterol sobre el crecimiento, desarrollo y respuestas a estrés biótico y abiótico en plantas de tomate. Los resultados obtenidos en esta tesis han confirmado que C22DES se dirige y retiene en la membrana del retículo endoplásmico (RE). C22DES consiste en dos dominios bien diferenciados: un dominio hélice transmembrana en el extremo amino-terminal (TMH1), que es suficiente para su direccionamiento y retención en la membrana del RE, y un dominio globular que también mantiene zonas de contacto con la membrana del RE. El dominio globular también puede interaccionar y ser retenido en el RE en ausencia de TMH1, pero es enzimáticamente inactivo, lo que revela la necesidad del dominio transmembrana amino-terminal para la actividad enzimática. Los análisis in silico de la región TMH1 revelaron algunas características que pueden estar implicadas en el reconocimiento y unión de sustrato. Se generaron plantas transgénicas de tomate con relaciones STIG/SIT alteradas mediante la sobreexpresión, silenciamiento mediado por amiRNA, y la eliminación del gen C22DES. Los resultados obtenidos mostraron que la ausencia de estigmasterol no es letal para la planta, ya que las plantas del genotipo mutante nulo C22des- son capaces de completar su ciclo de vida. Sin embargo, este mutante mostró algunas anormalidades fenotípicas relacionadas con procesos de crecimiento y desarrollo. Las plantas mutantes C22des- también mostraron aumentada su susceptibilidad a la infección por Botrytis cinerea.

Los datos proporcionados en esta tesis contribuyen a aumentar el conocimiento actual sobre los mecanismos de acción del estigmasterol y C22DES en plantas de tomate y sienta las bases para futuros estudios dedicados a desentrañar los mecanismos involucrados en la regulación de la actividad C22DES. El mutante C22des- generado en este trabajo también proporciona una herramienta única y de gran importancia para evaluar el papel del estigmasterol en las plantas.