Universitat Pompeu Fabra
Cerón Madrigal, Julián
2021-09-03
233 p.
Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut
In this thesis, I present an alternative, cloning-free method for the generation of endogenous fluorescent reporters in the nematode Caenorhabditis elegans. I demonstrate that Nested CRISPR is an efficient method that can be customized for the insertion of a suite of fluorescent tags and epitopes at endogenous loci using a combination of single-stranded and double-stranded DNA repair templates. In this thesis, I also demonstrate the use of enzymes other than Cas9 to target non-NGG PAM sites. The results show that AsCas12a can perform efficient genome editing in TTTV PAMs. Furthermore, the structurally engineered Cas9 variants SpG and SpRY can mediate genome editing in NGN and NYN PAMs, respectively, via both error-prone and precise repair mechanisms under optimized conditions.
En esta tesis presento un método alternativo, sin la necesidad de clonaciones moleculares, para la generación de reporteros endógenos fluorescentes en el nematodo Caenorhabditis elegans. Demuestro que Nested CRISPR es una técnica eficiente que puede ser adaptada para la inserción de diversos etiquetas y epítopos fluorescentes en loci endógenos empleando una combinación de moldes de reparación de ADN de cadena simple y doble. También demuestro el uso de enzimas distintas a Cas9 para cubrir secuencias PAM distintas de NGG. Los resultados muestran que AsCas12a puede realizar la edición genómica de manera eficiente en PAMs TTTV. Además, las variantes estructuralmente diseñadas de Cas9, SpG y SpRY, pueden llevar a cabo edición genómica en PAMs NGN y NYN respectivamente, mediante mecanismos propensos a errores y de reparación precisa, en condiciones optimizadas.
Genome editing; CRISPR; Caenorhabditis elegnas; Genetic engineering; Cas9 variants; Edición genómica; Caernohabditis elegans; Ingeniería genética; Variantes de Cas9
575 - General genetics. General cytogenetics
ADVERTIMENT. Tots els drets reservats. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
