Bombas de eflujo: más allá de la resistencia a los antibacterianos

Abstract

La resistència als antimicrobians representa una amenaça creixent per a la salut pública global. L’aparició de bacteris multiresistents ha limitat significativament les opcions terapèutiques per tractar infeccions bacterianes, la qual cosa complica el seu control i maneig clínic. Entre els diversos mecanismes de resistència, les bombes d’eflux juguen un paper clau, ja que poden expulsar diferents classes d’antimicrobians fora de la cèl·lula, reduint així la seva eficàcia; a més, intervenen en la virulència bacteriana i en fenotips associats a aquesta. En aquest context, l’OMS va actualitzar el 2024 la seva llista de patògens prioritaris per a la recerca de nous tractaments antibacterians; a la categoria de prioritat crítica on s’hi troben Acinetobacter baumannii resistent a carbapenems i espècies bacterianes de l’ordre Enterobacterales resistents a carbapenems i cefalosporines de tercera generació. Aquests patògens provoquen infeccions greus amb poques opcions de tractament, per la qual cosa el desenvolupament de noves teràpies és urgent. Una estratègia prometedora és el bloqueig de les bombes d’eflux, cosa que permetria restaurar l’eficàcia dels antimicrobians convencionals i disminuir la virulència dels patògens bacterians multiresistents. Aquesta Tesi Doctoral s’ha centrat en l’estudi de sistemes d’eflux homòlegs, formats per un transportador i el seu regulador transcripcional, en els patògens de prioritat crítica, filogenèticament distants: A. baumannii i Enterobacter cloacae, aquest darrer com a representant de l’ordre Enterobacterales. El primer estudi de la present Tesi Doctoral va abordar el sistema d’eflux AdeABC, pertanyent a la família RND, i AdeRS, un sistema de dos components. Es va analitzar específicament la proteïna de membrana interna AdeB i el regulador transcripcional AdeR en ambdós patògens. En primer lloc, es van generar mutants defectius en aquests gens i es va observar que la inactivació dels gens adeB i adeR en A. baumannii, així com l’homòleg adeR en E. cloacae, provoca un augment de la susceptibilitat a múltiples antibacterians, així com una disminució en la motilitat i la virulència. A més, el mutant defectiu en adeB de E. cloacae mostra una major sensibilitat a la colistina. Posteriorment, es va investigar el mecanisme de regulació d’AdeR en ambdues espècies. Els resultats van mostrar que aquest regulador conserva la seva funció entre A. baumannii i E. cloacae, demostrant la seva intercanviabilitat funcional tant en assaigs in vitro com in vivo. Finalment, una anàlisi in silico va confirmar que els gens adeB i adeR provenen d’un ancestre comú en aquests microorganismes. Tot i això, les diferències en les pressions selectives i en els nínxols ecològics haurien influït en la divergència funcional i la prevalença d’aquest sistema en ambdós patògens. El segon estudi es va centrar en el sistema d’eflux SxtP/R identificat per primera vegada en aquesta Tesi Doctoral. Aquest està compost pel transportador SxtP, de la família MFS, i pel regulador transcripcional SxtR, pertanyent a la família LysR. Primer, la caracterització fenotípica de mutants en sxtP i sxtR va revelar que en A. baumannii aquest sistema participa en la resistència a múltiples antimicrobians, així com en la motilitat i virulència. Tanmateix, en E. cloacae no es va observar un paper funcional rellevant de SxtP/R en aquests fenotips. Posteriorment, es va demostrar que en A. baumannii, SxtR actua com a activador transcripcional en unir-se directament a una seqüència específica d’ADN entre els gens sxtP i sxtR. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que els sistemes d’eflux estudiats estan implicats no només en la resistència als antimicrobians, sinó també en la patogènesi d’A. baumannii i E. cloacae. Malgrat la seva homologia, aquests sistemes han evolucionat adaptant-se de manera diferent a cada patogen. Aquests descobriments ofereixen noves oportunitats per dissenyar tractaments dirigits contra bombes d’eflux i els seus reguladors d’A. baumannii i E. cloacae.

La resistencia a los antimicrobianos representa una amenaza creciente para la salud pública global. La aparición de bacterias multirresistentes ha limitado significativamente las opciones terapéuticas para tratar infecciones bacterianas, lo que complica su control y manejo clínico. Entre los diversos mecanismos de resistencia, las bombas de eflujo juegan un papel clave, ya que expulsan distintas clases de antimicrobianos fuera de la célula, reduciendo así su eficacia; además, intervienen en la virulencia bacteriana y en fenotipos asociados a esta. En este contexto, la OMS actualizó en 2024 su lista de patógenos prioritarios para la búsqueda de nuevos tratamientos antibacterianos, en la categoría de prioridad crítica se encuentra Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos y especies del orden Enterobacterales resistentes a carbapenémicos y cefalosporinas de tercera generación. Estos patógenos provocan infecciones severas con escasas opciones de tratamiento, por lo que el desarrollo de nuevas terapias es urgente. Una estrategia prometedora es el bloqueo de las bombas de eflujo, lo cual permitiría restaurar la eficacia de antimicrobianos convencionales y disminuir la virulencia de patógenos bacterianos multirresistentes. Esta Tesis Doctoral se enfocó en el estudio de sistemas de eflujo homólogos, formados por un transportador y su regulador transcripcional, en los patógenos de prioridad crítica, filogenéticamente distantes: A. baumannii y Enterobacter cloacae, este último como representante del orden Enterobacterales. El primer estudio de la presente Tesis Doctoral abordó el sistema de eflujo AdeABC, perteneciente a la familia RND, y AdeRS, un sistema de dos componentes. Se analizó específicamente la proteína de membrana interna AdeB y el regulador transcripcional AdeR en ambos patógenos. En primer lugar, se generaron mutantes defectivos en estos genes y se observó que la inactivación de los genes adeB y adeR en A. baumannii, así como el homólogo adeR en E. cloacae, causa un aumento de la susceptibilidad a múltiples antibacterianos, así como una disminución en la motilidad y la virulencia. Además, el mutante defectivo en adeB en E. cloacae muestra una mayor sensibilidad a la colistina. Posteriormente, se investigó el mecanismo de regulación de AdeR en ambas especies. Los resultados mostraron que este regulador conserva su función entre A. baumannii y E. cloacae, demostrando su intercambiabilidad funcional tanto en ensayos in vitro como in vivo. Por último, un análisis in silico confirmó que los genes adeB y adeR provienen de un ancestro común en estos microorganismos. A pesar de ello, las diferencias en las presiones selectivas y en los nichos ecológicos habrían influido en la divergencia funcional y la prevalencia en ambos patógenos. El segundo estudio se centró en el sistema de eflujo SxtP/R identificado por primera vez en esta Tesis Doctoral. Este está compuesto por el transportador SxtP, de la familia MFS, y el regulador transcripcional SxtR, perteneciente a la familia LysR. Primero, la caracterización fenotípica de mutantes en sxtP y sxtR reveló que en A. baumannii este sistema participa en la resistencia a múltiples antimicrobianos, así como en la motilidad y la virulencia. Sin embargo, en E. cloacae no se observó un papel funcional relevante del sistema en dichos fenotipos. Posteriormente, se demostró que en A. baumannii, SxtR actúa como activador transcripcional al unirse directamente a una secuencia específica de DNA entre los genes sxtP y sxtR. En conjunto, los resultados de esta tesis demuestran que los sistemas de eflujo estudiados están implicados no solo en la resistencia a antimicrobianos, sino también en la patogénesis de A. baumannii y E. cloacae. A pesar de su homología, estos sistemas han evolucionado adaptándose de manera diferente en cada patógeno. Estos hallazgos ofrecen nuevas oportunidades para diseñar tratamientos dirigidos contra bombas de eflujo y sus reguladores de A. baumannii y E. cloacae.

Antimicrobial resistance represents a growing threat to global public health. The emergence of multidrug-resistant bacteria has significantly limited therapeutic options for treating bacterial infections, complicating their control and clinical management. Among the various resistance mechanisms, efflux pumps play a key role, as they expel different classes of antimicrobials out of the cell, thereby reducing their effectiveness; moreover, they are involved in bacterial virulence and associated phenotypes. In this context, the WHO updated in 2024 its list of priority pathogens for the development of new antibacterial treatments. In the critical priority category are included Acinetobacter baumannii resistant to carbapenems and species of the order Enterobacterales resistant to carbapenems and third-generation cephalosporins. These pathogens cause severe infections with limited treatment options, making the development of new therapies urgent. A promising strategy is the inhibition of efflux pumps, which would restore the efficacy of conventional antimicrobials and reduce the virulence of multidrug-resistant bacterial pathogens. This doctoral thesis focused on the study of homologous efflux systems, formed by a transporter and its transcriptional regulator, in phylogenetically distant critical priority pathogens: A. baumannii and Enterobacter cloacae, the latter as a representative of the order Enterobacterales. The first study of this Doctoral Thesis addressed the AdeABC efflux system, belonging to the RND family, and AdeRS, a two-component system. Specifically, the inner membrane protein AdeB and the transcriptional regulator AdeR were analyzed in both pathogens. Initially, knockout mutants in these genes were generated, and it was observed that inactivation of adeB and adeR genes in A. baumannii, as well as the homologous adeR in E. cloacae, caused increased susceptibility to multiple antibacterials, along with reduced motility and virulence. Additionally, the adeB defective mutant in E. cloacae showed increased sensitivity to colistin. Subsequently, the regulatory mechanism of AdeR was investigated in both species. The results showed that the AdeR regulatory function is maintained between A. baumannii and E. cloacae, demonstrating functional interchangeability in both in vitro and in vivo assays. Finally, an in silico analysis confirmed that adeB and adeR genes originate from a common ancestor in these microorganisms. Nevertheless, differences in selective pressures and ecological niches likely influenced functional divergence and prevalence in both pathogens. The second study focused on the SxtP/R efflux system, identified for the first time in this Doctoral Thesis. This system is composed of the transporter SxtP, belonging to the MFS family, and the transcriptional regulator SxtR, from the LysR family. First, phenotypic characterization of mutants in sxtP and sxtR revealed that in A. baumannii, this system participates in resistance to multiple antimicrobials, as well as in motility and virulence. However, no relevant functional role of the system in these phenotypes was observed in E. cloacae. Finally, it was demonstrated that in A. baumannii, SxtR acts as a transcriptional activator by directly binding to a specific DNA sequence located between the sxtP and sxtR genes. Taken together, the results of this thesis demonstrate that the studied efflux systems are involved not only in antimicrobial resistance but also in the pathogenesis of A. baumannii and E. cloacae. Despite their homology, these systems have evolved adapting differently in each pathogen. These findings provide new opportunities to design targeted treatments against efflux pumps and their regulators in A. baumannii and E. cloacae.