3D biohybrid hydrogels as artificial extracellular matrix for CAR T cell and organoid culture

Abstract

Aquesta tesi descriu el desenvolupament de nous hidrogels biohíbrids formats per poli(òxid d’etilè) – heparina com a matrius extracel·lulars artificials per a aplicacions en immunoteràpia i models de càncer. En particular, explora la millora de la producció ex vivo de productes de cèl·lules CAR T per a la immunoteràpia del càncer i en l’establiment de models d’organoides (tumoroides) tant de càncers hematològics com sòlids. Amb aquests objectius, hem optimitzat no només les propietats mecàniques i estructurals dels hidrògels biohíbrids, sinó també les propietats bioquímiques mitjançant l’addició de biomolècules rellevants a través de diferents estratègies químiques. A més, es va avaluar la introducció d’un mecanisme de gelificació dinàmic en els hidrogels mitjançant enllaços supramoleculars reversibles.

Més concretament, el capítol 2 mostra la preparació i caracterització dels hidrògels biohíbrids desenvolupats i utilitzats en aquesta tesi. Es descriu la síntesi de l’heparina funcionalitzada amb maleimida (Hep) i la seva gelificació amb poli(òxid d’etilè) de 4 braços (PEG) per formar els hidrògels estàndard, juntament amb les diferents modificacions realitzades. Es va seguir un enfocament de caracterització multitècnica per a tots els hidrogels descrits.

Al capítol 3, s’estudien i optimitzen les característiques fisicoquímiques de nous hidrogels PEG-Hep amb propietats similars als ganglis limfàtics per a la producció ex vivo de cèl·lules CAR T. Aquest capítol inclou un dels articles publicats recollits en aquesta tesi.

Al capítol 4, es discuteix la importància de les biomolècules, concretament citocines i molècules d’adhesió, en la modulació de funcions immunitàries mitjançant el comportament de cèl·lules T humanes primàries. En particular, els hidrogels PEG-Hep es funcionalitzen per interaccions electroestàtiques amb citoquines (CCL21, CCL19) i molècules d’adhesió (ICAM-1) per imitar els ganglis limfàtics, i s’avalua el seu impacte en la proliferació de cèl·lules T. Sorprenentment, es va observar que els ions fosfat presents en els medis biològics juguen un paper clau en la interacció entre la citoquina CCL21 i l’heparina.

Al capítol 5, s’avaluen hidrogels amb enllaços supramoleculars per introduir propietats dinàmiques al sistema i obtenir un hidrogel reversible. L’estratègia escollida per assolir aquest objectiu va ser una reacció amfitrió-lligand consistent en derivats de fenilalanina (Phe) units a l’esquelet de l’hidrogel com a lligands i cucurbit[8]uril (CB8) com a amfitrió supramolecular.

Al capítol 6, es discuteixen els avantatges dels hidrogels biohíbrids, que combinen polímers d’origen sintètic i natural, com a matrius extracel·lulars artificials per al cultiu d’organoides i tumoroides. Aquest capítol inclou el segon dels articles publicats recollits en aquesta tesi.

Finalment, al capítol 7, s’avaluen hidrogels biohíbrids per al cultiu de models organoides de càncer hematològic i sòlid. Concretament, s'han estudiat models de càncer colorectal i limfoma fol·licular derivats de pacients utilitzant hidrogels PEG-Hep.

L’últim capítol està dedicat a les conclusions i perspectives futures de la tesi. Addicionalment, s’hi inclou la meva trajectòria científica per explicar les activitats complementàries realitzades durant la tesi, com l’assistència a congressos o la supervisió d’estudiants de màster.

En resum, el treball d’aquesta tesi doctoral contribueix al desenvolupament de biomaterials avançats formats per hidrogels biohíbrids per a aplicacions oncològiques. En particular, s’han explorat hidrogels que imiten el teixit per a dues aplicacions complementàries en camps prometedors i en creixement com són la immunoteràpia i els models de càncer basats en organoides.

Esta tesis describe el desarrollo de nuevos hidrogeles biohíbridos compuestos por polietilenglicol (PEG) – heparina como matrices extracelulares artificiales para aplicaciones en inmunoterapia y como modelos de cáncer. En particular, nos centramos en mejorar la producción ex vivo de productos de células CAR T para inmunoterapia contra el cáncer, y en el establecimiento de modelos de organoides tumorales (tumoroides) tanto hematológicos como sólidos. Con estos objetivos, se dirigieron esfuerzos a optimizar no solo las propiedades mecánicas y estructurales de los hidrogeles biohíbridos, sino también las bioquímicas, mediante la incorporación de biomoléculas relevantes a través de diferentes estrategias químicas. Además, se evaluó la introducción de un control dinámico en los hidrogeles mediante enlaces supramoleculares reversibles.

Más concretamente, el capítulo 2 muestra la preparación y caracterización de los hidrogeles biohíbridos desarrollados y utilizados en esta tesis. Se presenta la síntesis de heparina funcionalizada con maleimida (Hep) y su gelificación con polietilenglicol de 4 brazos (PEG) para formar los hidrogeles estándar, junto con las distintas modificaciones realizadas. Se utilizó un enfoque de caracterización multitécnica para todos los hidrogeles descritos.

En el capítulo 3, se estudian y optimizan las características fisicoquímicas de nuevos hidrogeles PEG-Hep con propiedades que imitan los ganglios linfáticos para la producción ex vivo de productos de células CAR T. Este capítulo incluye uno de los artículos publicados recopilados en esta tesis.

En el capítulo 4, se discute la importancia de las biomoléculas, concretamente citoquinas y moléculas de adhesión, en la modulación de funciones inmunitarias mediante el comportamiento de células T humanas primarias. En particular, los hidrogeles PEG-Hep se funcionalizan mediante interacciones electrostáticas con citoquinas (CCL21, CCL19) y moléculas de adhesión (ICAM-1) para imitar los ganglios linfáticos, y se evalúa su impacto en la proliferación de células T. Sorprendentemente, se observó que los iones fosfato presentes en los medios biológicos juegan un papel clave en la interacción entre la citoquina CCL21 y la heparina.

En el capítulo 5, se evalúan hidrogeles con enlaces supramoleculares para introducir propiedades dinámicas en el sistema y obtener un hidrogel reversible. La estrategia elegida para ello fue una reacción anfitrión-ligando compuesta por derivados de fenilalanina (Phe) unidos a la matriz del hidrogel como ligandos y cucurbit[8]urilo (CB8) como anfitrión supramolecular.

En el capítulo 6, se discuten las ventajas de los hidrogeles biohíbridos, que combinan polímeros de origen sintético y natural, como matrices extracelulares artificiales para el cultivo de organoides y tumoroides. Este capítulo incluye el segundo de los artículos publicados recopilados en esta tesis.

Finalmente, en el capítulo 7, se evalúan hidrogeles biohíbridos para el cultivo de modelos organoides de cáncer tanto hematológico como sólido. En concreto, se valoran modelos de cáncer colorrectal y linfoma folicular derivados de pacientes utilizando hidrogeles PEG-Hep.

El último capítulo está dedicado a las conclusiones y a las perspectivas futuras de esta tesis. Además, se incluye mi trayectoria científica para explicar las actividades complementarias realizadas durante la tesis, como la asistencia a congresos o la supervisión de estudiantes de máster.

En resumen, el trabajo de esta tesis doctoral contribuye al desarrollo de biomateriales avanzados compuestos por hidrogeles biohíbridos para aplicaciones oncológicas. En particular, se han explorado hidrogeles que imitan tejidos para dos aplicaciones complementarias en campos prometedores y en expansión como la inmunoterapia y los modelos de cáncer basados en organoides.

This thesis describes the development of novel biohybrid hydrogels consisting of poly(ethylene glycol) – heparin as artificial extracellular matrices for applications in immunotherapy and cancer modelling. In particular, we focused on improving the ex vivo manufacture of CAR T cell products for cancer immunotherapy, and the establishment of both hematological and solid cancer organoid (tumoroid) models. With these objectives, efforts were directed to optimizing not only the mechanical and structural properties of the biohybrid hydrogels, but also the biochemical ones by the addition of relevant biomolecules through different chemical strategies. Moreover, we also assessed the introduction of a dynamic control into the hydrogels by a supramolecular reversible crosslinking. More specifically, chapter 2 shows the preparation and characterization of the biohybrid hydrogels developed and used in this thesis. The synthesis of maleimide functionalized heparin (Hep) and its crosslinking with 4-arm thiolate polyethylene glycol (PEG) to form the standard hydrogels is shown, together with the different modifications performed. A multi-technique characterization approach was followed for all described hydrogels. In chapter 3, the physicochemical characteristics of novel PEG-Hep hydrogels with lymph-node mimicking features are studied and optimized for the ex vivo manufacturing of CAR T cell products. This chapter includes one of the compiled published articles of this thesis. In chapter 4, the importance of biomolecules, namely cytokines and adhesion molecules, in the modulation of immune functions through primary human T cell behavior is discussed. In particular, PEG-Hep hydrogels are functionalized by electrostatic interactions with cytokines (CCL21, CCL19) and adhesion molecules (ICAM-1) to mimic the lymph nodes, and their impact on T cell proliferation is assessed. Surprisingly, phosphate ions present in biological buffers and cell media were seen to play a key role in the interaction between the cytokine CCL21 and heparin. In chapter 5, hydrogels comprising supramolecular crosslinks were assessed to introduce dynamic properties into the system and be able to obtain a reversible hydrogel. The strategy chosen to achieve this goal was a host-guest reaction consisting of phenylalanine derivatives (Phe) linked to the hydrogel backbone as guest molecules and cucurbit[8]uril (CB8) as a supramolecular host. In chapter 6, the advantages of biohybrid hydrogels, comprising both synthetic and natural origin polymers, as artificial extracellular matrices for organoid and tumoroid culture are discussed. This chapter includes the second of the compiled published articles of this thesis. Finally, in chapter 7, biohybrid hydrogels are assessed for the culture of both hematological and solid cancer organoid models. Specifically, colorectal and follicular lymphoma cancer models consisting of patient-derived cancer organoids are evaluated using PEG-Hep hydrogels. The last chapter is dedicated to the conclusions and future perspectives for this thesis. Additionally, my scientific trajectory is included to explain complementary activities performed during this thesis such as conference attendance or master student supervision. In summary, the work of this PhD thesis contributes to the development of advanced biomaterials consisting of biohybrid hydrogels for oncological applications. In particular, tissue mimicking hydrogels were explored for two complementary applications in promising and growing fields such as immunotherapy and organoid cancer models.