Polifosfato nuclear en células humanas: regulación enzimática, proteoma asociado y funciones emergentes

Abstract

El polifosfat és una biomolècula, majoritàriament lineal, composta per desenes fins a milers d’unitats de fosfat inorgànic unides per enllaços fosfoanhidre. A pH fisiològic presenta una elevada càrrega negativa. Està conservat al llarg de tota l’escala evolutiva i els estudis han revelat que té nombroses funcions fisiològiques, com la regulació de la transcripció, la reserva d’energia, la resposta a l’estrès oxidatiu... així com patològiques, com l’ELA o el càncer. Malgrat aquests descobriments, manca molt coneixement sobre les enzims implicades en el seu metabolisme en humans i sobre les proteïnes amb les quals es troba associat. En el nostre grup, mitjançant un estudi exhaustiu es va caracteritzar la primera endopolifosfatasa humana, NUDT3. Ara, en aquesta tesi, un dels objectius és desentranyar les particularitats de PRUNE1, un enzim homòleg a l’exopolifosfatasa Ppx1. En el present treball, a través de diferents tècniques, s’ha demostrat que

PRUNE1 és una exopolifosfatasa nuclear capaç de degradar el polifosfat de les cèl·lules HEK293T. El seu domini C-terminal presenta senyals d’interacció i fosforilació que podrien modificar-ne l’activitat, denotant una regulació complexa que dificulta la determinació dels seus paràmetres cinètics in vitro. S’ha demostrat que la seva activitat exopolifosfatasa està lligada a la seva capacitat d’augmentar la proliferació cel·lular. El segon objectiu del present treball, amb la finalitat de dilucidar noves funcionalitats del polifosfat, ha estat determinar una llista del proteoma associat al polyP. Per a això s’han utilitzat tècniques de proximity labeling associades a un pèptid que interacciona de forma específica amb el polyP. Aquesta llista està altament enriquida en factors d’splicing i diferents proteïnes relacionades amb els speckles. El polifosfat té una funció important en aquestes estructures a través de la seva interacció amb SRRM2 i SON. També s’ha estudiat la relació directa que té el polifosfat sobre diferents vies de reparació de l’ADN, així com en la replicació d’aquest mitjançant la seva interacció amb el complex helicasa. En conjunt, aquest treball posa sobre la taula funcionalitats del polifosfat, fins ara poc analitzades, que obren nous fronts relacionats amb aquesta antiga i desconeguda biomolècula.

El polifosfato es una biomolécula, mayoritariamente lineal, compuesta por decenas hasta miles de unidades de fosfato inorgánico unidos por enlaces fosfoanhidro. A pH fisiológico presenta una elevada carga negativa. Está conservado a lo largo de toda la escala evolutiva y los estudios han revelado que tiene numerosas funciones fisiológicas, como la regulación de la transcripción, la reserva de energía, la respuesta a estrés oxidativo... así como patológicas, como la ELA o el cáncer. A pesar de estos estos descubrimientos, falta mucho conocimiento sobre las enzimas implicadas en su metabolismo en humanos y de las proteínas con las que se encuentra asociado. En nuestro grupo, a través de estudio exhaustivo se caracterizó la primera endopolifosfatasa humana, NUDT3. Ahora, en esta tesis, se tiene como uno de los objetivos desentrañar las particularidades de PRUNE1, enzima homóloga a la exopolifosfatasa Ppx1. En el presente trabajo, a través de diferentes técnicas se ha demostrado que PRUNE1 es una exopolifosfatasa nuclear capaz de degradar el polifosfato de las células HEK293T. Su dominio Cterminal tiene señales de interacción y fosforilación que podrían modificar su actividad, denotando una regulación compleja que hace difícil determinar sus parámetros cinéticos in vitro. Se ha demostrado que su actividad exopolifosfatasa está ligada a su capacidad de aumentar la proliferación de las células. El segundo objetivo del presente trabajo, con el fin de dilucidar nuevas funcionalidades del polifosfato ha sido determinar una lista del proteoma asociado al polyP. Para ello se han usado técnicas de proximity labeling asociadas a un péptido que interacciona de forma específica con el polyP. Esta lista está altamente enriquecida en factores de splicing y diferentes proteínas relacionadas con los speckles. El polifosfato tiene una función importante en estas estructuras a través de su interacción con SRRM2 y SON. También se ha estudiado la relación directa que tiene el polifosfato sobre diferentes vías de reparación del ADN, así como en la replicación de este a través de su interacción con el complejo helicasa. En

conjunto, este trabajo pone sobre la mesa funcionalidades del polifosfato, hasta ahora pobremente analizadas, que abren nuevos frentes relacionados con esta antigua y desconocida biomolécula.