Aplicación de indicadores nativos de fluorescencia para la evaluación rápida de daño térmico en el procesado de leche

Abstract

L'objectiu d'aquesta tesi és l'aplicació d'indicadors nadius de fluorescència per a la quantificació ràpida dels canvis generats per la calor en diversos marcadors de dany tèrmic, com ara: hidroximetilfurfural (HMF), grups sulfhidril (-SH), àcid ascòrbic (AA ) i riboflavina (RBF) en llet desnatada mitjançant espectroscòpia de fluorescència "front-face". Es van dur a terme quatre experiments; en els dos primers es va estudiar la cinètica de desaparició i / o aparició dels marcadors indicats i, es van construir models cinètics a partir de la informació generada, així com de predicció mitjançant marcadors de fluorescència. En el tercer experiment, amb la utilització de dos fluorímetres diferents (sobretaula i fibra òptica), es van validar i recalibrar els models de predicció obtinguts anteriorment, emprant mostres generades en planta pilot en condicions industrials. En el cas dels models cinètics, aquests van ser validats i recalibrats combinant dades dels tres experiments per tal d'ampliar el nombre de mostres i obtenir models millorats. L'aparició i / o degradació dels marcadors químics estudiats es va ajustar a cinètiques de primer ordre. Es van estimar alguns paràmetres cinètics com ara l'energia d'activació, constant preexpronencial d'Arrhenius i coeficient tèrmic. Durant el procés de validació dels models matemàtics de predicció dels marcadors, indicadors estadístics com ara CV (coeficient de variació) i SEP (error estàndard de predicció) van resultar elevats; més encara amb les dades de fibra òptica, a causa de diferències de configuració òptica entre els espectròmetres de sobretaula i fibra òptica. Per això es va realitzar per una banda un recalibrat dels models de sobretaula amb les dades dels tres experiments, si bé en el cas de l'equip de fibra òptica es va procedir al calibratge emprant exclusivament dades de planta pilot generats amb el tercer experiment i consegüent validació mitjançant el mètode de validació creuada "leave one out". La fluorescència del triptòfan, compostos intermedis de Maillard i riboflavina excitada a 370 nm van ser els predictors més importants en el calibratge dels models. El millor model seleccionat tant per a l'equip de sobretaula com per al de fibra òptica va ser el corresponent a la predicció de l'àcid ascòrbic amb CV <12% mentre que els models amb major variabilitat d'error van ser els del hidroximetilfurfural amb CV <45%. En un quart experiment es va desenvolupar un mètode de quantificació ràpida de riboflavina mitjançant la mesura de fluorescència "front-face". Els valors obtinguts amb el model desenvolupat per quantificar la riboflavina en llets comercials no van ser significativament diferents dels obtinguts amb els mètodes convencionals (HPLC). La fluorescència "front-face" és un mètode ràpid, senzill i sense manipulació de mostra que permet calibrar models de predicció dels marcadors de dany tèrmic en llet. L'aplicació en línia dels models desenvolupats presenta potencial per a la millora del control dels tractaments tèrmics en llet, si bé els resultats obtinguts fins al moment indiquen que la implementació dels mateixos requeriria una etapa prèvia de calibratge en planta.

El objetivo de esta tesis es la aplicación de indicadores nativos de fluorescencia para la cuantificación rápida de los cambios generados por el calor en varios marcadores de daño térmico, tales como: hidroximetilfurfural (HMF), grupos sulfhidrilo (-SH), ácido ascórbico (AA) y riboflavina (Rbf) en leche desnatada mediante espectroscopía de fluorescencia “front-face”. Se llevaron a cabo cuatro experimentos: en los dos primeros se estudió la cinética de desaparición y/o aparición de los marcadores indicados y, a partir de la información generada, se construyeron modelos cinéticos, así como de predicción mediante marcadores de fluorescencia. En el tercer experimento, con la utilización de dos fluorímetros diferentes (sobremesa y fibra óptica), se validaron y recalibraron los modelos de predicción obtenidos anteriormente, empleando muestras generadas en planta piloto en condiciones industriales. En el caso de los modelos cinéticos, éstos fueron validados y recalibrados combinando datos de los tres experimentos a fin de ampliar el número de muestras y obtener modelos mejorados. La aparición y/o degradación de los marcadores químicos estudiados se ajustó a cinéticas de primer orden. Se estimaron algunos parámetros cinéticos tales como la energía de activación, la constante preexponencial de Arrhenius y el coeficiente térmico. Durante el proceso de validación de los modelos matemáticos de predicción de los marcadores, los indicadores estadísticos tales como CV (coeficiente de variación) y SEP (error estándar de predicción) resultaron elevados; más aún con los datos de fibra óptica, debido a diferencias de configuración óptica entre los espectrómetros de sobremesa y de fibra óptica. Por ello se realizó por una parte un recalibrado de los modelos de sobremesa con los datos de los tres experimentos, si bien en el caso del equipo de fibra óptica se procedió a la calibración empleando exclusivamente datos de planta piloto generados con el tercer experimento y consiguiente validación mediante el método de validación cruzada “leave one out”. La fluorescencia del triptófano, los compuestos intermedios de Maillard y la riboflavina excitada a 370 fueron los predictores más importantes en la calibración de los modelos. El mejor modelo seleccionado tanto para el equipo de sobremesa como para el de fibra óptica fue el correspondiente a la predicción del ácido ascórbico con CV<12% mientras que los modelos con mayor variabilidad de error fueron los del hidroximetilfurfural con CV<45%. En un cuarto experimento se desarrolló un método de cuantificación rápida de riboflavina mediante la medida de fluorescencia “front-face”. Los valores obtenidos con el modelo desarrollado para cuantificar la riboflavina en leches comerciales no fueron significativamente diferentes de los obtenidos con los métodos convencionales (HPLC). La fluorescencia “front-face” es un método rápido, sencillo y sin manipulación de muestra que permite calibrar modelos de predicción de los marcadores de daño térmico en leche. La aplicación en línea de los modelos desarrollados presenta un gran potencial para la mejora del control de los tratamientos térmicos en leche, si bien los resultados obtenidos hasta el momento indican que la implementación de los mismos requeriría una etapa previa de calibración en planta.

The objective of this thesis is the application of native indicators of fluorescence for the rapid quantification of heat-induced changes in several thermal damage markers, such as hydroxymethylfurfural (HMF), sulfhydryl groups(-SH), ascorbic acid (AA) and riboflavin (Rbf) in skim milk by front-face fluorescence spectroscopy. Four experiments were carried out: in the first two, the kinetics of disappearance and / or appearance of the indicated markers were studied and kinetic models were constructed from the information generated as well as prediction models by fluorescence markers. In the third experiment, with the use of two different fluorimeters (benchtop and optic fiber), the prediction models previously obtained were validated and recalibrated using samples generated in a pilot plant under industrial conditions. In the case of kinetic models, these were validated and recalibrated by combining data from the three experiments in order to increase the number of samples and obtain improved models. The appearance and / or degradation of the chemical markers studied was adjusted to first order kinetic equations. Some kinetic parameters such as activation energy, Arrhenius pre-exponential constant and thermal coefficient were estimated. During the validation process of the markers prediction models, statistical indicators such as CV (coefficient of variation) and SEP (standard error of prediction) were high; even higher with optic fiber data, due to differences in optical configuration between benchtop and optic fiber spectrometers. For this reason, a recalibration of the benchtop models with the data of the three experiments was carried out, although in the case of optic fiber equipment, calibration was carried out exclusively using the pilot plant data generated in the third experiment and validation using the leave one out cross validation method. The fluorescence of tryptophan, intermediates compounds of Maillard reaction and riboflavin excited at 370 nm were the most important predictors in the calibration of the models. The best model selected for both the benchtop and optic fiber equipment was the prediction of ascorbic acid with CV <12%, while the models with the highest error variability were for hydroxymethylfurfural with CV <45%. In a fourth experiment, a rapid quantification method of riboflavin was developed by the measurement of front-face fluorescence. The values obtained with the model developed to quantify riboflavin in commercial milks were not significantly different from those obtained with conventional methods (HPLC). Front-face fluorescence is a fast, simple method. Without the need of sample manipulation, allows calibration of thermal damage predictive models. The inline application of the developed models presents potential for the improvement of the control of thermal treatments in milk, although the results obtained so far indicate that the implementation of the models would require a previous stage of calibration in plant.