Influència de les cèl·lules endotelials progenitores sobre la modulació espaial i temporal de l’angiogènesi i la vasculogènesi després de l’ictus isquèmic humà

Abstract

L'ictus o infart cerebral es produeix com a resultat d'una alteració del flux sanguini cerebral que pot ser transitori, si es restableix espontàniament o mitjançant accions terapèutiques, o permanent. Aquesta malaltia suposa una de les primeres causes de mortalitat, juntament amb les malalties cardíaques i el càncer, en el món occidental. Actualment l'únic tractament disponible per a l'ictus isquèmic és l'administració de l'activador recombinant del plasminogen tissular (rt-PA) dintre de les 4,5h primeres hores des de l'inici dels símptomes. Tot i la seva eficàcia, evitant una mort/dependència de cada set pacients tractats menys del 5% del pacients amb ictus isquèmic es poden beneficiar d'aquesta teràpia. Per tant, són importants nous estudis dirigits a identificar noves dianes terapèutiques que ens permetin aplicar nous tractaments més efectius i segurs. La neuroreparació, és una estratègia terapèutica que permet recuperar tant la zona de penombra com formar nous circuits neuronals per restablir les funcions sensorials i motores perdudes. Processos com l'angiogènesi i la vasculogènesi tenen un paper clau en aquesta recuperació. És per aquest motiu, que l'objectiu d'aquesta tesi és estudiar el paper que juguen les cèl·lules endotelials progenitores (EPCs) i els nivells plasmàtics de diferents promotors i inhibidors angiogènics en el pronòstic clínic dels pacients que han patit un ictus isquèmic comparat amb controls sans. Es van fer extraccions sanguinies a pacients que havien patit un ictus isquèmic i havien rebut tractament trombolítico a diferents temps després de l'ictus i es van determinar els nivells en plasma mitjançant ELISA de PDGF-BB, HGF, FGF, VEGF, HB-EFG, PDGF-AA, KGF, TPO , VEGF-R1, VEGF-R2, TSP-1, TSP-2, endostatina, angiostatina, SDF- 1a i GM-CSF. Aquests valors es van correlacionar amb diferents parametres clínics (milloria, risc de TH) i escales neurològiques (NIHSS, rankin). Les EPCs es van aïllar a partir de la fracció mononuclear de pacients (en fase subaguda i fase aguda) i controls i la seva quantificació es va realitzar mitjançant el cultiu cel·lular i la citometria de flux. Es van fenotipar els diferents tipus de EPCs i es va determinar la seva funcionalitat mitjançant assajos de tubulogènesi en Matrigel . També es va analitzar la capacitat de secreció de factors angiogènics d'aquestes cèl·lules, així com la seva expressió gènica. Els resultats d'aquesta tesi mostren els nivells circulants d'EPCs determinats mitjançant citometria de flux es troben elevats en pacients amb ictus isquèmic comparat amb controls. De la mateixa manera, trobem una major capacitat de diferenciació a cèl·lula endotelial en els cultius cel·lulars de pacients amb ictus. Les EPCs obtingudes de pacients en la fase subaguda de l'ictus mostren una major funcionalitat in vitro que les obtingudes durant la fase aguda, i podrien se més eficients en teràpies de neuroreparació. Diferents promotors i inhibidors angiogènics es troben modulats després de l'ictus isquèmic. El nivells en plasma de PDGF-BB, d'endostatina i de TSP-2 i GM-CSF es troben augmentats en la fase hiperaguda de l'ictus comparat amb una població control.Una major angiogènesi endògena determinada pels nivells de VEGF, VEGF/endostatina o PDGF-BB/angiostatina s'associen a un menor dèficit neurològic a curt termini, sense incrementar el risc de TH. En canvi, nivells elevats de l'inhibidor angiogènic endostatina s'associen a un pitjor pronòstic funcional dels pacients al tercer mes.

Stroke is the third leading cause of death and the most common cause of permanent disability in adults worldwide. In the acute phase of stroke an energy loss caused by reduction of cerebral blood flow triggers multiple brain-cell death pathways. Currently, the only available treatment for stroke is the use of thrombolytic drugs to restore brain perfusion during the hyperacute phase. The National Institutes of Neurological Disorders Study (NINDS) and the European Cooperative Acute Stroke Study (ECASS) have described the beneficial effects of intravenous tissue plasminogen activator (tPA) administered up to 3–4.5 h after symptom onset of ischemic stroke. However, despite its proven efficacy, tPA is only given to less than 5% of stroke patients due to its narrow therapeutic window and the fact that it carries an increased risk of intracranial hemorrhage. Therefore, there is an urgent need for new stroke therapies applicable beyond the hyperacute phase. One promising therapeutic strategy is to induce neovascularization in the brain. Our aim was study the role of endothelial progenitor cells (EPCs) and the association between plasma levels of different angiogenic promoters and inhibitors and clinical outcome of ischemic stroke patients. Blood samples were drawn from tPA-stroke patients and controls at different time-points after ischemic event and plasma level of PDGF-BB, HGF, FGF, VEGF, HB-EFG, PDGF-AA, KGF, TPO , VEGF-R1, VEGF-R2, TSP-1, TSP-2, endostatina, angiostatina, SDF-1a and GM-CSF was determined. Angiogenic promoters and inhibitors levels were associated with different clinical parameters (TH, NIHSS and mRS scales). EPCs levels in each group were quantified by flow cytometry and cell culture assays. Immunophenotyping was performed using multiple markers (UEA-lectin, CD133, vWF and KDR) and tubulogenic function was assessed with the Matrigel® assay. The produced angiogenic factors were quantified by multiple ELISA and RT-PCR. Fluorescence activated cell sorting (FACS) revealed higher levels of circulating CD133+/CD34+/KDR+/CD45+ cells in the acute strokes as compared to the control subjects (p=0.02). On the other hand, more EPCs grew in cell culture from subacute strokes (p=0.016) than from controls. The endothelial and progenitor lineages of the EPCs were confirmed by immunophenotyping. Interestingly, the appearance of outgrowth EPCs (OECs) correlated positively to stroke severity (p=0.013). Finally, greater capacity to induce vasculogenesis in vitro was found in EPCs from subacute strokes (p=0.03), which we attribute to a higher expression and secretion of angiogenic factors. Baseline PDGF-BB, endostatin and thrombospondin-2 levels were higher in stroke patients than in controls (p<0.05). Most angiogenesis biomarkers showed a decrease during the first 24h alter stroke and a long recovery to baseline levels. A pro-angiogenic balance was associated with lower NIHSS scores and less intracranial hemorrhagic complications. Interestingly, a high baseline endostatin level was associated to long-term functional dependency.