Implicació dels canals de calci de tipus T en la regulació de l’autofàgia en el glioblastoma multiforme

Abstract

La present tesi estudia el paper dels canals de calci de tipus T (TT-CC) en la modulació de l’autofàgia en línies cel•lulars de glioblastoma, biòpsies derivades de pacients (GBM primaris i recurrències) i línies cel•lulars quimioresistents generades in vitro al nostre laboratori. Els TT-CC van ser descrits en la dècada dels 70 i en els últims anys estan cobrant importància en el camp de la investigació bàsica del càncer degut a la seva expressió diferencial respecte al teixit no tumoral, motiu pel qual destaquen com a potencials targets en el disseny de noves molècules o reutilització de medicaments orfes per al tractament de tumors sòlids com el GBM. EL GBM és un tipus de tumor cerebral astrocitari (grau IV de malignitat segons la OMS) de mal pronòstic caracteritzat per un ràpid creixement i amb un patró histopatològic comú a tots els tumors d’aquesta índole que revelen àrees necròtiques, zones d’elevada densitat cel•lular (zones de pseudopaliçada-hipòxiques) seguides d’extensions cel•lulars properes a vasos (riques en oxigen i nutrients). Els nostres resultats demostren que existeix una tendència a l’increment de l’expressió dels TT-CC que es correlaciona amb l’estadi (primari versus recurrent) en GBM. S’ha observat que en condicions normòxiques les cèl•lules de GBM expressen tot el seu ventall de TT-CC mentre que en condicions hipòxiques és la isoforma 2 (Cav3.2) qui adquireix tot el protagonisme. També hem relacionat una major expressió de TT-CC amb l’increment de l’autofàgia, procés pel qual les cèl•lules degraden orgànuls i proteïnes danyades amb la finalitat d’obtenir nutrients i energia en situacions que suposen un estrès cel•lular. Aquests resultats motiven a l’anàlisi dels TT-CC com a dianes terapèutiques en el GBM. EN aquesta línia hem trobat que els bloquejants de TT-CC, Mibefradil (medicament orfe) i NNC-55 desregulen el procés autofàgic, observant-se profundes alteracions en les vies de senyalització upstream i downstream d’autofàgia, inhibeixen la proliferació cel•lular in vitro i finalment son capaces d’induïr la mort cel•lular per apoptosi. Interessantment hem observat una sensibilitat major als bloquejants de TT-CC en condicions hipòxiques tan en cultius 2D com 3D. Finalment hem demostrat, a través del silenciament gènic, que cadascuna de les isoformes exerceix un efecte diferencial sobre la conducta autofàgica cel•lular en GBM relacionant positivament l’expressió de Cav3.1 amb la proteïna pro-autofàgica p62, encarregada de reclutar el cargo a degradar dins de l’autofagosoma. A més, suggerim un model de mecanisme d’acció en el que Cav3.1 podria actuar com a regulador transcripcional de p62, situant-lo en una posició estratègica en la regulació de l’autofàgia en GBM. Conjuntament, els resultats obtinguts en el curs d’aquesta tesi apunten a que els TT-CC com a possibles marcadors pronòstic i/o dianes terapèutiques en GBM.

La presente tesis estudia el papel de los canales de calcio de tipo T (TT-CC) en la modulación de la autofagia en líneas celulares de glioblastoma, biopsias derivadas de pacientes (GBM primarios y recurrencias) y líneas celulares quimioresistentes generadas in vitro en nuestro laboratorio. Los TT-CC fueron descritos en la década de los 70 y en los últimos años están cobrando importancia en el campo de la investigación básica del cáncer debido a su expresión diferencial respecto al tejido no tumoral, motivo por el cual llaman especialmente la atención como potenciales targets en el diseño de nuevas moléculas o reutilización de medicamentos huérfanos para el tratamiento tumores sólidos como el GBM. El GBM es un tipo de tumor cerebral astrocitario (grado IV de malignidad según las OMS) de mal pronóstico caracterizado por un rápido crecimiento y con un patrón histopatológico común a todos los tumores de esta índole que revelan áreas necróticas, zonas de elevada densidad celular (zonas de pseudopalizada- hipóxicas) seguidas de extensiones celulares cercanas a vasos (ricas en oxígeno y nutrientes). Nuestros resultados demuestran que existe una tendencia al incremento de expresión de los TT-CC que se correlaciona con el estadio (primario versus recurrente) en GBM. Se ha observado que en condiciones normóxicas las células de GBM expresan todo su abanico de TT-CC mientras que en condiciones hipóxicas es la isoforma 2 (Cav3.2) quien adquiere todo el protagonismo. También hemos relacionado una mayor expresión de TT-CC con el incremento de autofagia, proceso por el cual las células degradan orgánulos y proteínas dañadas con el fin de obtener nutrientes y energía en situaciones que suponen un estrés celular. Estos resultados motivan el análisis de los TT-CC como dianas terapéuticas en el GBM. En esta línea, hemos hallado que los bloqueantes de TT-CC, Mibefradil (medicamento huérfano) y NNC-55 desregulan el proceso autofágico, observándose profundas alteraciones en las vías de señalización upstream y downstream autofagia, inhiben la proliferación celular in vitro i finalmente son capaces de inducir la muerte celular por apoptosis. Interesantemente hemos observado una sensibilidad mayor a los bloqueantes de TT-CC en condiciones hipóxicas tanto en cultivos 2D como 3D. Finalmente hemos demostrado, a través de su silenciamiento génico, que cada una de las isoformas ejerce un efecto diferencial sobre la conducta autofágica celular en GBM relacionando positivamente la expresión de Cav3.1 con la proteína pro-autofágica p62, encargada de reclutar el cargo a degradar dentro del autofagosoma. Además, sugerimos un modelo de mecanismo de acción en el que Cav3.1 podría actuar como regulador transcripcional de p62, situándolo en una posición estratégica en la regulación de la autofagia en el GBM. Conjuntamente, los resultados obtenidos en el curso de esta tesis apuntan a los TT-CC como posibles marcadores de pronóstico y/o dianas terapéuticas en GBM.

The focus of this doctoral thesis has been to study the role of the T-type calcium channels (TT-CC) in the modulation of autophagy in glioblastoma cell lines, biòpsies derived from patients (primary GBM and recurrences) and chemorresistant cell lines generated in vitro in our laboratory. TT-CC were described in the 70s and in the recent years they are gaining importance in the field of basical cancer research because of the differential expression regarding non tumoral tissue, this is the reason why they call attenttion as a potential targets in the design of new molècules or the reuse of orphan medicines for the solid tumors as GBM. The GBM is an astrocytic brain tumor (graid IV malignancy according to WHO) with poor prognosis characterized by fast growth and a common hystopatological standart to al GBM tumors with necròtic areas, hiper-cellularized zones (pseudopalizada zone-hypoxic) followed by cells neared to bloog vessels (oxigen and nutrient rich). Our results show there is a trend to increase the expression of TT-CC correlated with the tumor stage (primary versus recurrence) in GBM. We have been observed that in normoxic conditions GBM cells express all the range of TT-CC whereas in hypoxic conditions is the isoform 2 (Cav3.2) which adquires all the leading role. Also we have connected a higher expression of TT-CC with the rise/ increase of autophagy, which is a cellular process in which cells degrade damaged proteins and organelles to obtein nutrients and energy under stressfull conditions.

This results encourage the TT-CC analysis as targets fot therapeutic intervention in GBM. In this regard, we have found that Mibefradil and NNC-55, TT-CC blockers, deregulate the autophagic process, notting important deep alterations in upstream and downstream signaling pathways that regulate the autophagic pathway, in vitro cell proliferation inhibition and finally they are capable to induce apoptotic cell death. Interestingly , we have noted a higher sensitivity to TT-CC in hypoxic conditions in 2D and also in 3D cell cultures. Finally we have proven by gene silencing experiments that every isoform has an effect on autophagic cell behaviour in GBM, linking the Cav3.1 expression with the p62 pro-autophagic protein which is responsible to reclute the cargo inside the autophagosome. Moreover, we hintet at a possible mechanism by which Cav3.1 could act as a transcriptional regulator of p62, placing the Cav3.1 in a strategic position as an autophagic regulator in GBM.

Altogether, the results attained in this thgesis point to T-type Ca2+ channels as putative prognosis markers and therapeutic targets in GBM.