Aislamiento y caracterización parcial de bacteriófagos de salmonella spp con potencial aplicación en el biocontrol sobre superficies

Abstract

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos los segmentos de la sociedad, involucra productores, desarrolladores, innovadores, consumidores y gobierno, además de diversos sectores como la industria, la ingeniería y hasta la educación. Sin embargo, las nuevas tecnologías en la cadena de producción provocan que ésta sea más larga y compleja. Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos de mortalidad. Entre los agentes infecciosos más comunes se encuentran Salmonella spp, Campylobacter spp, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. Los bacteriófagos o fagos son virus bacterianos específicos de una célula huésped, en la cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material genético. Son los sistemas biológicos más abundantes del planeta, se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven en la flora intestinal de otros seres cuando éstos ingieren diversos alimentos, ya sean de tipo animal o vegetal. El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de bacteriófagos de Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua recolectadas de diferentes localidades del área metropolitana de Monterrey, N. L., México. La purificación de bacteriófagos se llevó a cabo mediante la técnica de agar doble capa (ADC) hasta obtener placas líticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella como cultivos indicadores. Se aislaron un total de 15 bacteriófagos putativamente distintos, de los cuales, al pasar las pruebas de replicación, sólo uno logró mantener la capacidad lítica. Se seleccionó y purificó para realizar pruebas in vitro específicas para Salmonella (ATCC 19430). Se utilizó una concentración de bacteriófagos de 1x1012 UFP/ml para analizar al bacteriófago mediante su morfología por microscopía electrónica, la cual se identificó como miembro de la familia Siphoviridae. Así mismo, se probaron los bacteriófagos contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo, y para analizar el efecto de la infección del bacteriófago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable se utilizó el microscopio de epifluorescencia. Para el conteo de bacteriófagos se utilizó los métodos LIVE/DEAD y el recuento en placa de agar, la correlación entre ambos métodos fue de R2=0.82. Para finalizar, para evaluar la efectividad del bacteriófago MRH6 que resulto lítico en nuestro ensayo, se procedio a dar las condiciones necesaria para la formación del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero inoxidable. El bacteriófago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente. Las mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones de fago mayores a 1x108 UFP/mL. El método de cultivo mostró reducciones del patógeno a niveles indetectables; sin embargo, la tinción vital reveló la presencia de células viables (coloración verde), que podría representar un riesgo de contaminación cruzada, estas pudieran también presentarse por la presencia de material orgánico. Este trabajo con un bacteriófago puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminación de superficies de acero inoxidable con biofilms de Salmonella. La DEM resultó ser una buena herramienta para evaluar rápida y adecuadamente por observación y posterior análisis el efecto de los bacteriófagos.

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society, involving producers, developers, innovators, consumers, and government, as well as various sectors such as industry, engineering, and even education. However, new technologies in the production chain cause it to be longer and more complex. Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality. Among the most common infectious agents are Salmonella spp, Campylobacter spp, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell, in which they multiply by invading their machinery of genetic material. They are the most abundant biological systems on the planet, they can be found in the environment. In organisms, they enter and coexist in the intestinal flora of other beings when they ingest various foods, whether animal or vegetable. The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of bacteriophages of Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different locations in the metropolitan area of Monterrey, N. L., México. The purification of bacteriophages was carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures. A total of 15 putatively different bacteriophages were isolated, of which, upon passing the replication tests, only one managed to maintain the lytic capacity. It was selected and purified to perform specific in vitro tests for Salmonella (ATCC 19430). A bacteriophage concentration of 1x1012 PFU / ml was used to analyze the bacteriophage by means of its electron microscopy morphology, which was identified as a member of the Siphoviridae family. Likewise, the bacteriophages against Salmonella were tested in situ on steel discs simulating the work surfaces, and the epifluorescence microscope was used to analyze the effect of bacteriophage infection on Salmonella on the stainless steel discs. For the bacteriophage count, the LIVE / DEAD methods and the agar plate count were used, the correlation between both methods was R2 = 0.82. Finally, in order to evaluate the effectiveness of the bacteriophage MRH6 that was lytic in our trial, the necessary conditions for the formation of the Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established. The bacteriophage MRH6 was able to disintegrate the biofilms at room temperature. The greatest reductions of Salmonella in a shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFU / mL. The culture method showed reductions of the pathogen to undetectable levels; however, vital staining revealed the presence of viable cells (green coloration), which could represent a risk of cross contamination, these could also be presented by the presence of organic material. This work with a bacteriophage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel surfaces with Salmonella biofilms. The DEM proved to be a dependable tool to quickly and adequately evaluate the effect of bacteriophages by observation and subsequent analysis.