Cell Stress and RNA Splicing in Amyotrophic Lateral Sclerosis: Novel Opportunities for Therapeutic Development

Abstract

L'ELA és una malaltia neurodegenerativa multifactorial. Atès que actualment és una malaltia incurable sense una causa coneguda, els esforços per descobrir noves dianes terapèutiques estan ben justificats. L'evidència disponible indica que la fisiopatologia de l'ELA pot estar composta parcialment d'interaccions entre alteracions de lípids, estrès oxidatiu, deslocalització de TDP-43 i metabolisme de l'ARN. Per explorar l'impacte de la deslocalització de TDP-43, quantifiquem per primera vegada l’splicing críptic derivat de la disfunció de TDP-43 en teixit humà, models cel·lulars i ratolins. Els exons críptics són candidats a biomarcadors en l'ELA, i els quantifiquem en altres patologies relacionades amb alteracions de TDP-43, com la demència tipus Alzheimer-LATE. Un dels ARNm controlats per TDP-43 codifica per ATG4B, una proteïna essencial en la formació de la maquinària de membrana de l'autofàgia. D'altra banda, les membranes de el sistema nerviós central estan enriquides en àcids grassos poliinsaturats (PUFA), molt sensibles a l'estrès oxidatiu. Les publicacions anteriors de el grup demostren una disminució en l'àcid docosahexaenoic (DHA) -un PUFA- a la medul·la espinal dels donants d'ELA. El DHA és un regulador crucial de la inflamació i s'ha relacionat amb malalties neurodegeneratives relacionades amb l'edat. Aquesta tesi mostra que la intervenció dietètica pot augmentar eficaçment el contingut de DHA de la medul·la espinal mitjançant l'ús d'una dieta enriquida amb DHA, que té un efecte beneficiós en la supervivència dels ratolins transgènics mascles. Aquesta millora es va associar amb una disminució dels marcadors inflamatoris i de dany de l'ADN. A causa de que s'observa un dany en l'ADN similar i un perfil d'alliberament de citocines en el perfil secretor associat a la senescència (SASP) en la neuroinflamació, també examinem el paper potencial de la senescència en l'ELA. Vam detectar nivells augmentats de marcadors SASP i signes de senescència cel·lular (expressió augmentada de p16-INK i p21) en etapes presimptomàtiques i simptomàtiques en la medul·la espinal dels ratolins hSOD1-G93A. No obstant això, el tractament senolític amb Navitoclax (un inhibidor de Bcl-2) no va oferir cap benefici en la supervivència dels ratolins ni una disminució dels nivells d'expressió de gens de senescència cel·lular i marcadors SASP. També vam demostrar que l'splicing críptic augmenta en ratolins hSOD1-G93A en l'etapa final i es correlaciona amb el marcador de senescència p16-INK. Finalment, per millorar el potencial de transferència, vam explorar les alteracions de l'splicing críptic i canvis metabolòmics com a potencials biomarcadors perifèrics. Desafortunadament, els exons críptics mesurats en teixit nerviós no s'expressen en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica. No obstant això, les anàlisis del metaboloma plaquetari van revelar canvis significatius en els enfocaments de casos-controls i de pronòstic. En conclusió, aquesta tesi destaca les noves troballes relacionades amb possibles intervencions dietètiques i senolítics, i proposa nous biomarcadors metabolòmics i transcriptòmics.

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa multifactorial. Dado que actualmente es una enfermedad incurable sin una causa conocida, los esfuerzos para descubrir nuevas dianas terapéuticas están bien justificados. La evidencia disponible indica que la fisiopatología de la ELA puede estar compuesta parcialmente de interacciones entre alteraciones de lípidos, estrés oxidativo, deslocalización de TDP-43 y metabolismo del ARN. Para explorar el impacto de la deslocalización de TDP-43, cuantificamos por primera vez el splicing críptico derivado de la disfunción de TDP-43 en tejido humano, modelos celulares y ratones. Los exones crípticos son candidatos a biomarcadores en la ELA, y los cuantificamos en otras patologías relacionadas con alteraciones de TDP-43, como la demencia tipo Alzheimer-LATE. Uno de los ARNm controlados por TDP-43 codifica para ATG4B, una proteína esencial en la formación de la maquinaria de membrana de la autofagia. Por otro lado, las membranas del sistema nervioso central están enriquecidas en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), muy sensibles al estrés oxidativo. Las publicaciones anteriores del grupo demuestran una disminución en el ácido docosahexaenoico (DHA) -un PUFA- en la médula espinal de los donantes de ELA. El DHA es un regulador crucial de la inflamación y se ha relacionado con enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad. Esta tesis muestra que la intervención dietética puede aumentar eficazmente el contenido de DHA de la médula espinal mediante el uso de una dieta enriquecida con DHA, que tiene un efecto beneficioso en la supervivencia de los ratones transgénicos machos. Esta mejora se asoció con una disminución de los marcadores inflamatorios y de daño del ADN. Debido a que se observa un daño en el ADN similar y un perfil de liberación de citocinas en el perfil secretor asociado a la senescencia (SASP) en la neuroinflamación, también examinamos el papel potencial de la senescencia en la ELA. Detectamos niveles aumentados de marcadores SASP y signos de senescencia celular (expresión aumentada de p16-INK y p21) en etapas presintomáticas y sintomáticas en la médula espinal de los ratones hSOD1-G93A. Sin embargo, el tratamiento senolítico con Navitoclax (un inhibidor de Bcl-2) no ofreció ningún beneficio en la supervivencia de los ratones ni una disminución de los niveles de expresión de genes de senescencia celular y marcadores SASP. También demostramos que el splicing críptico aumenta en ratones hSOD1-G93A en la etapa final y se correlaciona con el marcador de senescencia p16-INK. Por último, para mejorar el potencial de transferencia, exploramos las alteraciones del splicing críptico y cambios metabolómicos como potenciales biomarcadores periféricos. Desafortunadamente, los exones crípticos medidos en tejido nervioso no se expresan en células mononucleares de sangre periférica. No obstante, los análisis del metaboloma plaquetario revelaron cambios significativos en los enfoques de casos-controles y de pronóstico. En conclusión, esta tesis destaca los hallazgos novedosos relacionados con posibles intervenciones dietéticas y senolíticos, y propone nuevos biomarcadores metabolómicos y transcriptómicos.

ALS is a multifactorial neurodegenerative disease. As it is currently an incurable disease without a known cause, the efforts in discovering novel targets are well justified. Available evidence indicates that ALS pathophysiology can be partially comprised of interactions between lipid alterations, oxidative stress, TDP-43 mislocalization, and RNA metabolism. In order to explore the impact of TDP-43 mislocalization, we quantified for the first time the cryptic exon splicing derived from TDP-43 dysfunction in human tissue, cell models, and mice. Cryptic exons are candidate biomarkers in ALS, and we quantified them in other pathologies related to TDP-43 disturbances, such as the Alzheimer-LATE type dementia. One of the TDP-43 controlled mRNAs is codifying for ATG4B, an essential protein at the build-up of autophagy's membranal machinery. On the other hand, the central nervous system membranes are enriched in polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which are very sensitive to oxidative stress. The group's previous publications indicated a decrease in docosahexaenoic acid (DHA) -a PUFA- in ALS donors' spinal cord. DHA is a crucial regulator of inflammation and has been implicated in age-related neurodegenerative diseases. This thesis shows that dietary intervention can effectively increase DHA content of the spinal cord by using a DHA enriched diet, which has a beneficial effect on male survival time. This improvement was associated with decreased inflammatory and DNA damage markers. Because a similar DNA damage and cytokine release profile are seen in senescence-associated secretory profile (SASP) in neuroinflammation, we also examined the potential role of senescence in ALS. We detected increased levels of SASP markers and signs of cell senescence (increased expression of p16-INK and p21) in pre- and symptomatic stages in the hSOD1-G93A ALS spinal cord. However, a senolytic treatment with Navitoclax (a Bcl-2 inhibitor) did not offer any benefit in mice survival nor a decreased level of cell senescence and SASP markers. We also demonstrate that cryptic exon splicing is increased in the hSOD1-G93A ALS model at the end-stage, and it is correlated with senescence marker p16-INK mRNA. Finally, to enhance transference potential, we explored both metabolomic and cryptic exon splicing alterations in peripheral biomarkers. Unfortunately, cryptic exons measured in nervous tissue are not expressed in peripheral blood mononuclear cells. Notwithstanding, platelet metabolome analyses revealed significant changes in case-control and prognostic approaches. Globally, this thesis highlights novel findings related to potential dietary interventions, open the door for new therapeutic agents such as senolytic and propose new metabolomics and transcriptomic biomarkers.