Generation and validation of a CRISPR platform for rapid and inducible genome editing in human pluripotent stem cells and kidney organoids

Abstract

Our current knowledge about the function of human genes is mostly based on data from genetic studies using animal models. However, divergence among species may hamper the understanding of genetic mechanisms underlying human specific traits. Nowadays, an alternative to animal models stands on the generation of organ-like cultures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs), the so called organoids. In the last years, the organoids have proved to recapitulate, in a high extent, the development, multicellular architecture, and physiology of human organs. To perform genetic studies in these valuable models, methods for rapid and controllable genetic manipulation of hPSCs are needed. To fulfill this need, the generation of an inducible CRISPR platform (iCRISPR) previously enabled efficient and inducible genome editing in hPSCs. Nevertheless, iCRISPR had important limitations hampering further transgenesis for expanding its possible applications. Based on iCRISPR, this thesis describes the generation of a new iCRISPR2 (iC2) platform with improved versatility for transgenesis. We generated selection-free hPSCs with monoallelic insertions of an inducible Cas9 expression module at the AAVS1 locus. Engineered iC2 hPSCs were then exploited for the high-throughput generation of stable and inducible KO hPSCs lines, precise KI hPSCs lines, and a reporter hPSCs line. In addition, the iC2 platform was repurposed for the generation of hPSCs for controlled gene regulation by CRISPR/dCas9 systems. Finally, some stable and inducible KO hPSCs were differentiated into kidney organoids to study the role of LHX1 and VHL in kidney development and disease. Our results showed that LHX1 function is required for renal vesicle formation prior nephrogenesis, as well as that VHL depletion impairs mitochondrial respiration in tubular cells derived from kidney organoids. On balance, iCRISPR2 technology could be applied in any hPSCs-based differentiation model to systematically dissect gene function in human development, physiology and disease

Nuestros conocimientos sobre la genética humana se basan mayormente en datos procedentes de estudios genéticos realizados con modelos animales. Sin embargo, la divergencia entre especies puede dificultar la comprensión de los mecanismos genéticos que subyacen a los rasgos específicos del ser humano. Actualmente, una alternativa al uso de modelos animales se basa en la generación de cultivos similares a órganos mediante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), llamados organoides. En los últimos años, los organoides han demostrado recapitular, en gran medida, el desarrollo, la arquitectura multicelular y la fisiología de los órganos humanos. Para realizar estudios genéticos en estos valiosos modelos, se necesitan métodos de manipulación genética rápida y controlable de las hPSCs. Para cubrir esta necesidad, la generación previa de una plataforma inducible de la tecnología CRISPR (iCRISPR) ha permitido la edición del genoma de las hPSCs de una forma eficiente y regulable. Sin embargo, iCRISPR tiene importantes limitaciones que dificultan procesos de transgénesis que permitan ampliar sus posibles aplicaciones. Basada en iCRISPR, esta tesis describe la generación de una nueva plataforma iCRISPR2 (iC2), con mayor versatilidad para la transgénesis. En este trabajo hemos generado hPSCs libres de genes de resistencia a antibióticos y con inserciones monoalélicas en el locus AAVS1 que permiten la expresión inducible de la proteína Cas9. La nueva plataforma iC2 ha sido explotada para modificar con un alto rendimiento el genoma de hPSCs e introducir así mutaciones de pérdida de función génica (KO) estables e inducibles, mutaciones precisas y genes reporteros. Además, la plataforma iC2 se ha re propuesto para la generación de hPSCs que permitan la regulación controlada de genes mediante sistemas CRISPR/dCas9. Finalmente, algunas hPSCs con mutaciones KO se han diferenciado en organoides renales para poder estudiar el papel de genes como LHX1 o VHL en el desarrollo y la enfermedad renal. Nuestros resultados han demostrado que la función de LHX1 es necesaria para la formación de vesículas renales antes de la nefrogénesis, así como que la pérdida de VHL perjudica la respiración mitocondrial en las células tubulares derivadas de organoides renales. En definitiva, la tecnología iCRISPR2 podría aplicarse en cualquier modelo de diferenciación basado en hPSCs para diseccionar sistemáticamente la función de los genes en el desarrollo, la fisiología y las enfermedades humanas.