The Microtubule Nucleator γTuRC: Reconstitution and Analysis of its Assembly Mechanism

Abstract

The microtubule nucleator γ-tubulin ring complex (γTuRC) is essential for the function of microtubule organizing centers such as the centrosome. Since its discovery over two decades ago, γTuRC has evaded in vitro reconstitution and thus detailed structure-function studies. In my doctoral thesis, I reveal a previously unknown role of the RUVBL1- RUVBL2 AAA-ATPase complex (RUVBL) in mediating assembly of γTuRC. Specifically, human tissue culture cells that lack RUVBL display altered γTuRC subunit composition and localization to the centrosome. In a heterologous co-expression system, RUVBL is sufficient to assemble γTuRC from a minimal set of core subunits. Importantly, RUVBL interacts with γTuRC subcomplexes but is not part of fully assembled γTuRC. Reconstituted, purified γTuRC has moderate nucleation activity and its cryo-EM structure at ~4.0 Å resolution, which we determine through collaborative work, resembles native γTuRC. Detailed analysis of this structure identifies features that determine the intricate, higher-order γTuRC architecture. Besides γTuRC, I report the first reconstitution of human γ-tubulin small complex (γTuSC), a γTuRC subcomplex. Taking advantage of the recombinant expression system, I perform mutational analysis to dissect the roles of MZT1 and MZT2 subunits and their interactions with the N-terminal extensions (NTEs) of GCP3 and GCP2, respectively. This reveals how MZT:NTE units affect the γTuSC core structure and RUVBL-mediated γTuRC assembly. Together, this work discovers RUVBL as an assembly factor that regulates γTuRC in cells and allows production of recombinant human γ-tubulin complexes, defines the minimal set of γTuRC core subunits, and provides the first tool to allow recombinant production of γTuRC for in-depth mechanistic studies of γTuRC assembly and γTuRC-mediated microtubule nucleation.

El complejo nucleador de microtúbulos en anillo de γ-tubulina (γTuRC) es esencial para la función de los centros organizadores de microtúbulos, como el centrosoma. Desde su descubrimiento hace más de dos décadas, γTuRC ha evitado su reconstitución in vitro y, por tanto, los estudios detallados de estructura-función. En mi tesis doctoral, revelo un papel hasta ahora desconocido del complejo AAA-ATPasa RUVBL1-RUVBL2 (RUVBL) en la mediación del ensamblaje de γTuRC. En concreto, las células de cultivo de tejidos humanos que carecen de RUVBL muestran una composición alterada de las subunidades de γTuRC y su localización en el centrosoma. En un sistema de coexpresión heteróloga, RUVBL es suficiente para ensamblar γTuRC a partir de un conjunto mínimo de subunidades principales. Es importante destacar que RUVBL interactúa con los subcomplejos de γTuRC pero no forma parte del γTuRC completamente ensamblado. El γTuRC reconstituida y purificada tiene una actividad de nucleación moderada y su estructura crio-EM a una resolución de ~4,0 Å, que determinamos mediante un trabajo de colaboración, se asemeja a la γTuRC nativa. El análisis detallado de esta estructura identifica características que determinan la intrincada arquitectura de orden superior de γTuRC. Además de γTuRC, informo de la primera reconstitución del complejo pequeño de γ-tubulina (γTuSC) humano, un subcomplejo de γTuRC. Aprovechando el sistema de expresión recombinante, realizo un análisis mutacional para diseccionar las funciones de las subunidades MZT1 y MZT2 y sus interacciones con las extensiones N-terminales (NTEs) de GCP3 y GCP2, respectivamente. Esto revela cómo las unidades MZT:NTE afectan a la estructura del núcleo de γTuSC y al ensamblaje de γTuRC mediado por RUVBL. En conjunto, este trabajo descubre que RUVBL es un factor de ensamblaje que regula γTuRC en las células y permite la producción de complejos de γ-tubulina humano recombinante, define el conjunto mínimo de subunidades del núcleo de γTuRC y proporciona la primera herramienta que permite la producción recombinante de γTuRC para realizar estudios mecanísticos en profundidad del ensamblaje de γTuRC y la nucleación de microtúbulos mediada por γTuRC.