Deciphering ischemic stroke: multi-omic techniques to discover new biomarkers and therapeutic targets

Abstract

L’ictus isquèmic és una causa de mort i discapacitat majoritària al món. Una millor comprensió de la seva fisiopatologia és fonamental per millorar aquestes dades devastadores. Més enllà de les teràpies trombolítiques aprovades no hi ha cap tractament efectiu per mitigar-ne la progressió. A més, aquestes teràpies tenen una finestra terapèutica curta i efectes secundaris greus, reduint el nombre de pacients que se’n poden beneficiar. Per tant, hi ha una necessitat de trobar noves estratègies terapèutiques complementàries per atenuar la progressió de l’ictus. A més, identificar els pacients amb més risc de presentar mal pronòstic (discapacitat o mort) després d’un ictus és essencial per facilitar els processos de presa de decisions i optimitzar la gestió dels pacients. En aquest sentit, és necessària la identificació de biomarcadors sanguinis que ajudin a predir el pronòstic de l’ictus. Aquesta Tesi Doctoral pretén contribuir a una millor comprensió de la fisiopatologia de l’ictus identificant noves molècules clau que poden servir com a dianes terapèutiques i/o com a biomarcadors pronòstic de l’ictus. En primer lloc, hem descrit els canvis del proteoma i transcriptoma que es produeixen en el cervell humà després de la isquèmia cerebral mitjançant tècniques –òmiques. A més, hem integrat aquesta informació mitjançant eines bioestadístiques per destacar molècules clau en la fisiopatologia de l’ictus. Alguns dels candidats proposats mostren potencial com a biomarcadors i/o dianes terapèutiques per l’ictus isquèmic. A més, s’ha explorat la influència del sexe, l’edat i les comorbiditats en la fisiopatologia de l’ictus mitjançant eines bioestadístiques d’integració explorant similituds i diferències en el proteoma i el transcriptoma cerebral en un model d’isquèmia cerebral en ratolins (a) mascles joves, (b) femelles joves, (c) mascles joves diabètics i (d) mascles vells. Curiosament, hem trobat que la resposta a la isquèmia cerebral és diferent entre els grups estudiats, posant de manifest la importància d’incorporar animals amb fenotips diferents en futurs estudis pre-clínics. A més, s’han realitzat tres estudis per explorar el paper de candidats seleccionats com a biomarcadors pronòstics de l’ictus. Curiosament, hem trobat que el nivell circulant d’Aquaporin-4 mesurat de manera aguda després d’un ictus isquèmic prediu la millora neurològica a les 48 hores i a l’alta hospitalària. En la mateixa línia, el nivell circulant d’alfa-1 antitripsina (A1AT) mesurat en la fase hiperaguda de l’ictus prediu un mal pronòstic funcional a l’hospital i a mig termini. Cal destacar que l’A1AT es va trobar sobre-expressada al cervell després de la isquèmia cerebral en el primer estudi d’aquesta Tesi. A més, hem identificat que l’endostatina, el receptor del factor de necrosi tumoral-1 i la interleucina-6 són predictors independents de la mortalitat a llarg termini després d’un ictus en una cohort de gairebé 1000 pacients. En tots els casos, els biomarcadors afegien valor predictiu a les variables clíniques. Finalment, com que tots els agents neuroprotectors proposats fins ara han fracassat a les clínica, en aquesta Tesi hem identificat diverses combinacions de dos fàrmacs amb efectes neuroprotectors sinèrgics. Per fer-ho, hem utilitzat un enfocament basat en la biologia de sistemes per desenvolupar un model matemàtic que simula la patologia de l’ictus isquèmic in silico. Notablement, l’eficàcia de la combinació de fàrmacs formada per Ceruletide+A1AT s’ha demostrat en un model d’isquèmia cerebral en ratolí i s’han descartat les possibles interaccions amb l’activador tissular del plasminogen recombinant (rt-PA). En conjunt, els resultats d’aquesta Tesi Doctoral contribueixen a aprofundir en el coneixement de la fisiopatologia de l’ictus, revelant molècules clau amb possibles funcions com a dianes terapèutiques, biomarcadors pronòstics o ambdues. De fet, hem descrit com l’A1AT es podria utilitzar tant com a biomarcador de mal pronòstic com a diana terapèutica quan es combina amb Ceruletide.

El ictus isquémico es una causa de muerte y discapacidad mayoritaria en el mundo. Una mejor comprensión de su fisiopatología es fundamental para mejorar estos datos devastadores. Más allá de las terapias trombolíticas aprobadas no existe ningún tratamiento efectivo para mitigar su progresión. Además, estas terapias tienen una ventana terapéutica corta y efectos secundarios graves, reduciendo el número de pacientes que pueden beneficiarse. Por tanto, hay una necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas complementarias para atenuar la progresión del ictus. Además, identificar a los pacientes con mayor riesgo de presentar mal pronóstico (discapacidad o muerte) después de un ictus es esencial para facilitar los procesos de toma de decisiones y optimizar la gestión de los pacientes. En este sentido, es necesaria la identificación de biomarcadores sanguíneos que ayuden a predecir el pronóstico del ictus. Esta Tesis Doctoral pretende contribuir a una mejor comprensión de la fisiopatología del ictus identificando nuevas moléculas clave que pueden servir como dianas terapéuticas y/o biomarcadores pronóstico del ictus. En primer lugar, hemos descrito los cambios del proteoma y transcriptoma que se producen en el cerebro humano después de la isquemia cerebral mediante técnicas –ómicas. Además, hemos integrado esta información mediante herramientas bioestadísticas para destacar moléculas clave en la fisiopatología del ictus. Algunos de los candidatos propuestos muestran potencial como biomarcadores y/o dianas terapéuticas para el ictus. Además, se ha explorado la influencia del sexo, la edad y las comorbilidades en la fisiopatología del ictus mediante herramientas bioestadísticas de integración explorando similitudes y diferencias en el proteoma y el transcriptoma cerebral en un modelo de isquemia cerebral en ratones (a) machos jóvenes, (b) hembras jóvenes, (c) machos jóvenes diabéticos y (d) machos viejos. Hemos encontrado que la respuesta a la isquemia cerebral es diferente entre los grupos estudiados, poniendo de manifiesto la importancia de incorporar animales con distintos fenotipos en futuros estudios pre-clínicos. Además, se han realizado tres estudios para explorar el papel como biomarcadores pronósticos del ictus de candidatos seleccionados. Hemos encontrado que el nivel circulante de Aquaporin-4 medido de forma aguda después de un ictus isquémico predice la mejora neurológica a las 48 horas y al alta hospitalaria. También, el nivel circulante de alfa-1 antitripsina (A1AT) medido en la fase hiperaguda del ictus predice un mal pronóstico funcional en el hospital y a medio plazo. Cabe destacar que A1AT se encontró sobre-expresada en el cerebro después de la isquemia cerebral en el primer estudio de esta Tesis. Además, hemos identificado que la endostatina, el receptor del factor de necrosis tumoral-1 y la interleucina-6 son predictores independientes de la mortalidad a largo plazo después de un ictus en una cohorte de casi 1000 pacientes. En todos los casos, los biomarcadores añadían valor predictivo a las variables clínicas. Por último, dado que todos los agentes neuroprotectores propuestos hasta ahora han fracasado en la clínica, en esta Tesis hemos identificado diversas combinaciones de dos fármacos con efectos neuroprotectores sinérgicos. Para ello, hemos utilizado un enfoque basado en la biología de sistemas para desarrollar un modelo matemático que simula la patología del ictus isquémico in silico. La eficacia de la combinación de fármacos formada por Ceruletide+A1AT se ha validado en un modelo de isquemia cerebral en ratón y se han descartado las posibles interacciones con el activador tisular del plasminógeno recombinante (rt-PA). En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral contribuyen a profundizar en el conocimiento de la fisiopatología del ictus, revelando moléculas clave con posibles funciones como dianas terapéuticas, biomarcadores pronósticos o ambas. De hecho, hemos descrito cómo el A1AT se podría utilizar tanto como biomarcador de mal pronóstico como diana terapéutica cuando se combina con Ceruletide.

Ischemic stroke is a leading cause of death and disability worldwide. A better comprehension of stroke pathophysiology is fundamental to improve its dramatic outcome. Beyond the approved thrombolytic therapies, there is no effective treatment to mitigate its progression. Besides, these reperfusion therapies have a short therapeutic window and severe side effects, reducing the number of patients that can benefit from them. Thus, there is an urgent need to find new complementary therapeutic strategies to attenuate or even reverse stroke progression. Moreover, identifying the patients at higher risk of presenting poor outcome (disability or death) after stroke is essential to facilitate decision-making processes, ultimately optimizing patients’ management. In this regard, the identification of blood biomarkers that aid in the prediction of stroke prognosis is highly needed. This Doctoral Thesis aims to contribute to the better understanding of stroke pathophysiology identifying new key molecules that can serve as therapeutic targets and/or as biomarkers of stroke prognosis. First, we have described proteomic and transcriptomic changes in the human brain triggered after cerebral ischemia using –omic techniques and integrating this information through biostatistical tools to highlight key molecular factors in the stroke pathophysiology. In this regard, some of the proposed candidates show potential as stroke biomarkers and/or therapeutic targets. Moreover, the influence of sex, age and comorbidities in stroke pathophysiology has been explored through integrative biostatistical tools by exploring similarities and differences in the brain proteome and transcriptome in a mice model of cerebral ischemia in (a) young males, (b) young females, (c) diabetic young males and (d) aged males. Interestingly, we found that the response to cerebral ischemia differed among the studied groups, highlighting the importance of incorporating animals with different phenotypes in future stroke research pre-clinical studies. Furthermore, three studies have been conducted to explore the role of selected candidates as blood biomarkers to predict stroke outcome. Interestingly, we found that Aquaporin-4 circulating level measured acutely after ischemic stroke predicts neurological improvement at 48 hours and at hospital discharge. In the same line, Alpha-1 antitrypsin (A1AT) circulating level measured in the hyperacute phase after stroke predicts poor functional outcome in-hospital and at mid-term. Of note, A1AT was a molecule found to be dysregulated in the brain after cerebral ischemia in the first study of this Doctoral Thesis. Moreover, we have identified that Endostatin, tumor necrosis factor receptor-1 and interleukin-6 are independent predictors of long-term mortality after stroke in a cohort of nearly 1000 patients. In all cases, the studied biomarkers added predictive value on top of clinical variables. Finally, since all neuroprotective agents proposed to date have systematically failed to succeed in clinics, in this Thesis we have identified various two-by-two combinations of drugs with theoretical synergistic neuroprotective effects. To do so, we have used a systems biology-based approach to develop a mathematical model that simulates in silico ischemic stroke pathology. Remarkably, the efficacy of the drug combination formed by Ceruletide + A1AT has been demonstrated in a mouse model of transient cerebral ischemia and its potential interactions with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA) have been discarded. Overall, the results of this Doctoral Thesis contribute to advancing our knowledge of stroke pathophysiology, disclosing key molecules with plausible roles as therapeutic targets, prognostic biomarkers or both. In fact, we have described how A1AT, a serine proteinase inhibitor found to be upregulated in ischemic stroke, could be used both as a biomarker of in-hospital and mid-term poor functional outcome and as a therapeutic target when combined with Ceruletide.