Estudi de les funcions reguladores de les regions transcrites ultraconservades (T-UCRs) sobre l’expressió gènica

Abstract

[cat] Els RNAs no codificants tenen un paper important com a reguladors de les funcions biològiques del desenvolupament i la fisiologia, i per tant la seva desregulació pot tenir un impacte en diverses patologies. Estan expressats de manera molt específica en diferents tipus cel·lulars i de teixits, però són especialment abundants en el sistema nerviós actuant sobre la regulació de xarxes neurals, i també estan implicats en malalties relacionades amb els trastorns del neurodesenvolupament. Les regions transcrites ultraconservades (T-UCR) són un tipus característic de RNAs no codificants llargs (≥200 pb de longitud) derivats de seqüències de DNA que són 100% idèntiques entre l’espècie humana, la de rata i la de ratolí. La seva expressió està alterada en molts tipus de tumors i diferents malalties, i tot i que s'ha proposat un paper per als T-UCR com a reguladors de l'expressió gènica, les seves funcions segueixen sent encara molt desconegudes. Aquest treball descriu dos mecanismes d’acció diferents dels T-UCR en distints contextos patològics de cèl·lules neurals. En primer lloc, en línies cel·lulars de glioma, descobrim un nou mecanisme regulador a través de la interacció RNA:RNA per complementarietat de bases, mitjançant el qual el transcrit ultraconservat uc.160+, que es silencia epigenèticament en els gliomes, millora la biogènesi de diversos membres de la família dels miR-376. Això inclou la regulació positiva del processament dels microRNA primaris (pri-miRNA) a nivell del tall de Drosha-DGCR8 i un augment dels esdeveniments d'edició A-to-I a la regió seed de la seva seqüència madura, que porta a alterar l’especificitat de les seves dianes. Com a conseqüència, l'expressió de l'uc.160+ repercuteix negativament sobre els nivells proteics d’almenys dos dels gens regulats pels miR-376: la proteïna d’unió als coreguladors transcripcionals RING1 i a YY1 (RYBP) i el factor de transcripció FOXP2 (forkhead box P2). Els nostres resultats experimentals demostren que l'efecte de l'uc.160+ s’anul·la mitjançant l'ús d'antagomiRs contra els miRs-376a i c, o amb la supressió del clúster miR-376 mediada per CRISPR/Cas9, confirmant la connexió d’aquests dos tipus de RNAs no codificants amb la complexa xarxa reguladora de l’expressió gènica. A més a més, el silenciament epigenètic per hipermetilació del DNA de l'illa CpG de l’uc.160+ està associat a una major taxa de supervivència en aquells pacients amb glioma de grau baix i, fins i tot, amb l’IDH1 WT, posant de manifest la importància de les regions ultraconservades en la fisiopatologia del càncer. Finalment la metilació de l’uc.160+ es demostra com a un factor pronòstic independent associat a una millor supervivència global en glioma de grau inferior, cosa que suggereix el seu potencial com a biomarcador en pacients amb glioma. En segon lloc, els T-UCR intergènics: uc.478 i uc479 s’han vist alterats en diferents models de la síndrome de Rett (RTT), una malaltia severa del neurodesenvolupament causada principalment per mutacions de novo en el gen MeCP2, lligat al cromosoma X. Els nivells d’expressió de l’uc.478 i l’uc479 es correlacionen negativament amb els del gen hoste GRIA3, membre dels complexos receptors AMPA, la qual cosa suggereix una potencial regulació negativa entre els T-UCR i el seu gen hoste. L'expressió forçada de l’uc.148 i l’uc.149, en cèl·lules progenitores neurals salvatges o knock-out per MeCP2, mostra un manteniment de les característiques de pluripotència a nivell de progenitores en un context RTT, i una disminució marcada de la complexitat neuronal glutamatèrgica, tant a nivell morfològic, com a nivell molecular amb una reducció dels marcadors canònics de les neurones glutamatèrgiques: VGLUT1 i VGLUT2, a través de la regulació de GRIA3. Aquests resultats desvetllen l’impacte de les transcripcions ultraconservades sobre la fisiologia de les cèl·lules neurals en el context RTT i suggereixen que poden contribuir a alteracions clau d’aquesta malaltia revelant el seu potencial com a biomarcadors.

[eng] Transcribed ultraconserved regions (T-UCRs) are long-noncoding RNAs derived from DNA sequences that are entirely conserved across species. Their expression is altered in many tumor types and different diseases, and even though a role for T-UCRs as regulators of gene expression has been proposed, their functions remain largely unknown. This work describes two different mechanisms of actions of T-UCRs in distinct pathological contexts of neural cells. First, in glioma cell lines, we uncover a novel RNA-RNA regulatory mechanism by which the ultraconserved uc.160+ enhances the biogenesis of several members of the miR-376 family through base‐pairing complementarity. This includes the positive regulation of primary microRNA (pri-miRNA) cleavage by DROSHA/DGCR8 and an increase in the A-to-I editing events on its mature sequence. As a consequence, the expression of uc.160+ impairs the levels of the downstream miR-376-regulated genes: the transcriptional coregulators RING1 and YY1-binding protein (RYBP), and the forkhead box P2 (FOXP2) proteins. The effect of uc.160+ is abolished by the use of antagomiRs against miR-376a and c, or by CRISPR/Cas9-mediated deletion of the miR-376 cluster, confirming the link between these two types of ncRNAs in gene expression regulatory networks. Additionally, epigenetic silencing by hypermethylation of the uc.160+ CpG island is an independent prognostic factor associated with better overall survival in lower-grade glioma, suggesting its potential as a biomarker in patients with glioma. Second, the analysis of the T-UCR population in a human cellular model of Rett syndrome (a severe neurodevelopmental disease) indicates that the intragenic uc.478 and uc.479 RNAs are overexpressed in mutant cells, both in neural progenitors and differentiated cells. Their levels are negatively correlated with those of the host GRIA3 gene, a member of the AMPA receptor complexes. Of note, enforced expression of uc.478 and uc.479 affects the glutamatergic neuronal complexity at the morphological and molecular level through the cis-regulation of the GRIA3 gene. This suggests a broad effect of ultraconserved transcripts on neural stem cell physiology in the context of Rett syndrome.