Unraveling biotic and environmental factors driving fungal dynamics

Abstract

Els fongs són microorganismes que juguen un paper crucial en els processos ecosistèmics. D'entre tots els grups funcionals de fongs (sapròfits, floridures, paràsits, etc.), els fongs micorízics són especialment importants donada la seva funció en l'adquisició de nutrients limitants per al creixement de les plantes que, al seu torn, són transferits al seu arbre simbiont. Dins dels processos ecosistèmics proporcionats per les micorizes, també s'inclouen alguns amb rellevància econòmica, com són la producció de cossos fructífers. La investigació de la dinàmica del miceli dels fongs i la seva interacció amb altres microorganismes del sòl ens proporciona una profunda visió de l'ecologia fúngica. A més, la quantificació del miceli dels fongs possibilita el seguiment del desenvolupament del fong abans de la seva fructificació, permetent un monitoratge de l'èxit del cultiu quan ens trobem davant d'una plantació de fongs comestibles. La tesi aquí presentada té com a objectiu investigar l'ecologia dels fongs avaluant diferents estructures fúngiques (miceli i micorizes), les interaccions microbianes dels fongs (bacteri i altres fongs del sòl) i les comunitats fúngiques associades per comprendre els mecanismes implicats en el desenvolupament dels fongs ectomicorízics relacionant-los al seu torn amb factors ambientals. En la present tesi, es va estimar la producció i la taxa de reemplaçament del miceli de micorrizes en boscos Mediterranis de Pinus pinaster, Pinus sylvestris and Quercus ilex. Aquestes estimacions es van correlacionar amb les espècies d'arbre o les condicions de sequera-humitat on es trobaven. Es va continuar centrant la nostra investigació en dues de les espècies de tòfones més cultivades: la tòfona negra (Tuber melanosporum) i la tòfona d'estiu (Tuber aestivum). La biomassa de miceli de les dues espècies va ser avaluada quan les dues tòfones van ser plantades, prèviament inoculades en plàntules de Q. ilex, en una plantació experimental a Maials (Lleida, Spain). Combinant tres tractaments de encoixinat (encoixinat blanc, encoixinat negre i sense encoixinat com a control), i dos règims de reg (reg i no reg com a control), es va investigar la dinàmica del miceli quan les dues espècies són presents al sòl i quan no, en els diferents tractaments i avaluant en quatre temporades diferents (al maig i al novembre de 2017 i 2018). Vam continuem la nostra recerca en l'ecologia d'aquestes dues espècies de tòfones en aquelles zones Mediterrànies i de clima temperat on les dues tòfones coexisteixen (tant en plantacions com en zones silvestres). En aquestes localitzacions, la biomassa de miceli va ser quantificada en tres èpoques de mostreig (hivern 2018, primavera 2019 i estiu 2019), i la comunitat fúngica del sòl va ser avaluada en les mostres de sòl recollides. Finalment, es va testar com afectava la inoculació conjunta de fong-bacteri en la taxa de colonització fúngica i la seva possible influència en el creixement d'arrels en plàntules de Quercus faginea. Per a aquest últim objectiu, es va inocular T. melanosporum amb tres bacteris (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida i Bacillus amyloliquefaciens). El medi de cultiu d'aquests bacteris va ser testat també, i els sis tipus d'inòcul juntament amb un control (plàntules només inoculades amb T. melanosporum) es van realitzar en dos temps d’inoculació diferents (un mes i nou mesos després de la inoculació amb tòfona ). Els nostres resultats van demostrar que la menor variabilitat estacional de la biomassa del miceli es va donar en els boscos de Q. ilex, mentre que en els boscos de Pinus spp., la biomassa de miceli va disminuir a principis de la tardor i a principis d'hivern. No obstant això, les diferències de producció de miceli i de renovació de miceli no van diferir entre els diferents tipus de boscos. Les estimacions de producció de miceli i de renovació de miceli van variar entre 7.2-9.9 vegades any-1 i 1.4-5.9 kg ha-1d-1 respectivament, i estaven positivament correlacionades amb les condicions d'humitat presents. La biomassa de les dues espècies de tòfona seleccionades (T. melanosporum i T. aestivum) van estar positivament influenciades per les condicions de major humitat sota de l'encoixinat blanc, on es va quantificar la major biomassa per a ambdues espècies. No obstant això, sota el encoixinat blanc i quan les dues espècies eren presents en el sòl, la biomassa de T. melanosporum va ser més gran que la de T. aestivum en els tractaments de reg, i el contrari en els tractaments sense reg. D'altra banda, no es van observar diferències significatives de quantitat de biomassa de miceli present comparant els seus diferents hàbitats (silvestre vs. plantació) i / o zones climàtiques (Mediterrànies vs. temperades). Tot i això, observem que la probabilitat de trobar T. melanosporum en les mostres de sòl agafades en zones Mediterrànies va ser més gran que les recollides en zones temperades, mentre que T. aestivum no va mostrar preferència per cap de les regions climàtiques. A més, les anàlisis de comunitat van revelar que la comunitat fúngica estava fortament influenciada per l'hàbitat (independentment de l'espècie arbòria) en comptes de per la zona climàtica. La temporada de mostreig no va afectar la composició fúngica del sòl, ni a la diversitat fúngica ni a l'abundància dels grups fúngics funcionals. Es va observar major diversitat de fongs micorízics en les zones silvestres que en les plantacions. En canvi, quan la comunitat fúngica total va ser analitzada, es van observar els majors valors de diversitat en zones temperades. A més, les floridures van ser el grup funcional que va marcar la diferència comparant comunitats fúngiques de plantacions i zones naturals, amb una major abundància en aquestes últimes. Finalment, els nostres resultats van revelar que el bacteri P. fluorescens va ser el millor bacteri promotor del creixement de les arrels de les plàntules de Q. faginea i, també, el que més va incrementar els percentatges de micorizació de T. melanosporum, amb més d'un 10 % de àpexs colonitzats de tòfona comparat amb els pertanyent tractament control. No obstant això, no es va trobar cap influència dels diferents temps d'inoculació testats, ni en la taxa de micorizació ni en les característiques de les arrels. En resum i basant-nos en aquests resultats, es conclou que (i) la dinàmica del miceli pot variar amb el canvi climàtic i, a més, que les espècies resistents a la sequera estan més adaptades a mantenir una biomassa de miceli més estable que les que no ho estan. (ii) Es planteja la possibilitat de el cultiu de T. melanosporum en zones Mediterrànies afectades per sequera estival si el seu cultiu és recolzat per la utilització de reg i encoixinat blanc. (Iii) Malgrat el canvi climàtic, T. melanosporum és encara l'espècie de tòfona que més freqüent es troba a la zona Mediterrània comparada amb T. aestivum. També, s’ha observat la forta influència de la successió ecològica (etapa de successió primerenca en plantacions i més avançada en zona silvestre) i el menor efecte de l'espècie arbòria a la comunitat fúngica del sòl. Finalment, (iv) la inoculació conjunta de T. melanosporum i el bacteri P. fluorescens es planteja com una opció factible en la seva aplicació en vivers comercials per a millora de qualitat de planta inoculada.

Los hongos son microorganismos que juegan un papel crucial en los procesos ecosistémicos. De entre todos los grupos funcionales de hongos (saprófitos, mohos, parásitos, etc.), los hongos micorrícicos son especialmente importantes dada su función en la adquisición de nutrientes limitantes para el crecimiento de las plantas que, a su vez, son transferidos a su árbol simbionte. Dentro de los procesos ecosistémicos proporcionados por las micorrizas, también se incluyen algunos con relevancia económica, como son la producción de cuerpos fructíferos. La investigación de la dinámica del micelio de los hongos y su interacción con otros microorganismos del suelo nos proporciona una profunda visión de la ecología fúngicos. Además, la cuantificación del micelio de los hongos posibilita el seguimiento del desarrollo del hongo antes de su fructificación, permitiendo una monitorización del éxito de cultivo cuando nos encontramos ante una plantación de hongos comestibles. La tesis aquí presentada tiene como objetivo investigar la ecología de los hongos evaluando diferentes estructuras fúngicas (micelio y micorrizas), las interacciones microbianas de los hongos (bacteria y otros hongos del suelo) y las comunidades fúngicas asociadas para comprender los mecanismos implicados en el desarrollo de los hongos ectomicorrícicos relacionándolo a su vez con factores ambientales. En la presente tesis, se estimó la producción y la tasa de remplazamiento de micelio de micorrizas en bosques Mediterráneos de Pinus pinaster, Pinus sylvestris and Quercus ilex. Dichas estimaciones se correlacionaron con las especies de árbol o las condiciones de sequía-humedad en donde se encontraban. Se continuó centrando nuestra investigación en dos de las especies de trufas más cultivadas: la trufa negra (Tuber melanosporum) y la trufa de verano (Tuber aestivum). La biomasa del micelio de ambas especies fue evaluada cuando ambas trufas fueron plantadas, previamente inoculadas en plántulas de Q. ilex, en una plantación experimental en Maials (Lleida, Spain). Combinando tres tratamientos de acolchado (acolchado blanco, acolchado negro y sin acolchado como control), y dos regímenes de riego (riego y no riego como control), se investigó la dinámica del micelio cuando ambas especies están presentes en el suelo y cuando no, en los diferentes tratamientos y evaluándolo en cuatro temporadas diferentes (en Mayo y en Noviembre de 2017 y 2018). Continuamos nuestra investigación en la ecología de estas dos especies de trufas en aquellas zonas Mediterráneas y de clima templado donde las dos trufas coexisten (tanto en plantaciones como en zonas silvestres). En estas localizaciones, la biomasa del micelio fue cuantificada en tres épocas de muestreo (invierno 2018, primavera 2019 y verano 2019), y la comunidad fúngica del suelo fue evaluada en las muestras de suelo recogidas. Finalmente, se testó cómo afectaba la inoculación conjunta de hongo-bacteria en la tasa de colonización fúngica y su posible influencia en el crecimiento de raíces en plántulas de Quercus faginea. Para este último objetivo, se inoculó T. melanosporum con tres bacterias (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, and Bacillus amyloliquefaciens). El medio de cultivo de dichas bacterias fue testado también, y los seis tipos de inóculo junto con un control (plántulas solamente inoculadas con T. melanosporum) se realizaron en dos tiempos de inoculación diferentes (un mes y nueve meses después de la inoculación con trufa). Nuestros resultados demostraron que la menor variabilidad estacional de la biomasa del micelio se dio en los bosques de Q. ilex, mientras que en los bosques de Pinus spp., la biomasa de micelio disminuyó a principios del otoño y a principios de invierno. Sin embargo, las diferencias de producción de micelio y de renovación de micelio no difirieron entre los diferentes tipos de bosques. Las estimaciones de producción de micelio y de renovación de micelio variaron entre 7.2-9.9 veces año-1 y 1.4-5.9 kg ha-1d-1 respectivamente, y estaban positivamente correlacionadas con las condiciones de humedad presentes. La biomasa de las dos especies de trufa seleccionadas (T. melanosporum and T. aestivum) estuvieron positivamente influenciadas por las condiciones de mayor humedad debajo del acolchado blanco, donde se cuantificó la mayor biomasa para ambas especies. Sin embargo, debajo del acolchado blanco y cuando ambas especies estaban presentes en el suelo, la biomasa de T. melanosporum fue mayor que la de T. aestivum en los tratamientos de riego, y lo opuesto en los tratamientos sin riego. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas de cantidad de biomasa de micelio presente comparando sus diferentes hábitats (silvestre vs plantación) y/o zonas climáticas (Mediterráneas vs templadas). A pesar de ello, observamos que la probabilidad de encontrar T. melanosporum en las muestras de suelo cogidas en zonas Mediterráneas fue mayor que las recogidas en zonas templadas, mientras que T. aestivum no mostró preferencia por ninguna de las regiones climáticas. Además, los análisis de comunidad revelaron que la comunidad fúngica estaba fuertemente influencia por el hábitat (independientemente de la especie arbórea) en vez de por la zona climática. La temporada de muestreo no afectó a la composición fúngica del suelo, ni a la diversidad fúngica ni a la abundancia de los grupos fúngicos funcionales. Se observó mayor diversidad de hongos micorrícicos en las zonas silvestres que en las plantaciones. En cambio, cuando la total comunidad fúngica fue analizada, se observaron los mayores valores de diversidad en zonas templadas. Además, los mohos fue el grupo funcional que marcó la diferencia comparando comunidades fúngicas de plantaciones y zonas naturales, con una mayor abundancia en éstas últimas. Finalmente, nuestros resultados revelaron que la bacteria P. fluorescens fue la mejor bacteria promotora del crecimiento de las raíces de las plántulas de Q. faginea y, también, la que más incrementó los porcentajes de micorrización de T. melanosporum, con más de un 10% de ápices colonizados de trufa comparado con los pertenecientes al tratamiento control. Sin embargo, no se encontró ninguna influencia de los diferentes tiempos de inoculación testados, ni en la tasa de micorrización ni en las características de las raices. En resumen y basándonos en estos resultados, se concluye que (i) la dinámica del micelio puede variar con el cambio climático y, además, que las especies resistentes a la sequía están más adaptadas a mantener una biomasa de micelio más estable que aquellas que no lo están. (ii) Se plantea la posibilidad del cultivo de T. melanosporum en zonas Mediterráneas afectadas por sequía estival si su cultivo es apoyado por la utilización de riego y acolchado blanco. (iii) A pesar del cambio climático, T. melanosporum es aún la especie de trufa que más frecuente se encuentra en la zona Mediterránea comparada con T. aestivum. También, se h observado la fuerte influencia de la sucesión ecológica (etapa de sucesión temprana en plantaciones y más avanzada en zona silvestre) y el menor efecto de la especie arbórea en la comunidad fúngica del suelo. Finalmente, (iv) la inoculación conjunta de T. melanosporum y la bacteria P. fluorescens se plantea como una opción factible en su aplicación en viveros comerciales para mejora de calidad de planta inoculada.

Fungi are microorganisms that play an important role in ecosystem processes. Among all fungi functional groups (saprobes, moulds, parasitic, etc.), mycorrhizal fungi are relevant for their function of acquisition and transfer of growth limiting nutrients to their symbiotic host plant. In addition, ecosystem processes provided by mycorrhiza fungi includes some with relevant economic interest, as the production of edible sporocarps. The investigation of fungal mycelium dynamics and fungal interaction with other soil microorganisms provides insights into ecology of fungi. In addition, quantifying the fungal biomass mycelium enables fungi tracing before sporocarp formation allowing the monitoring of cultivation success when edible fungi are grown. The presented thesis targeted research into fungal ecology by evaluating different fungal structures (mycelium and mycorrhizal root tips), microbial fungal interactions (bacteria other soil fungi) and the fungal microbial community associated in order to further understand biotic mechanism involve in ectomycorrhizal fungi development relating it in turn to environmental factors. In the presented thesis, the production and turnover rates of extramatrical mycorrhizal mycelium was assessed in Mediterranean Pinus pinaster, Pinus sylvestris and Quercus ilex forests. The estimates were related to tree-species and drought-moisture conditions. Afterwards, we have focused our research on the two most cultivated truffle species: the black truffle (Tuber melanosporum) and the summer truffle (Tuber aestivum). The mycelium biomass when both truffle species are planted together, previously inoculated in Q.ilex seedlings, was studied at a young experimental plantation in Maials (Lleida, Spain). Combining three soil mulch treatments (white mulch, black mulch and bare soil as a control) and two irrigation regimes (irrigated and non-irrigated as a control), truffle mycelial dynamics was investigated when both truffle species co-occur or not in the soil under the different treatments and evaluated at four sampling seasons (May and November in 2017 and 2018). We continue our research in the ecology of these two truffle species in Mediterranean and temperate areas where both truffles co-exists (either in plantations or in the wild). In these locations, mycelium biomass was quantified during three sampling seasons (winter 2018, spring 2019 and summer 2019) and soil fungal community was assessed in the collected soil samples. Finally, we aimed to shed light on the effect of bacteria-fungi co-inoculation on fungal root tip colonization and seedling root traits of Quercus faginea seedlings. For this last objective, we co-inoculated T. melanosporum with three selected bacteria (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, and Bacillus amyloliquefaciens). The bacteria growing media itself was also tested and a control treatment (seedlings just inoculated with T. melanosporum). The seven inoculation types were performed at two different times (one month and nine months after truffle inoculation). Our results showed that seasonality in mycelial biomass was the lowest in Q. ilex forests, while in Pinus spp. forest, mycelium biomass declined in early autumn and early winter. However, mycelial production and mycelial turnover rates were not differing between forest types. The estimates of mycelial turnover and production varied between 7.2-9.9 times yr-1 and 1.4-5.9 kg ha-1d-1 respectively, and were positively correlated with moisture conditions. Mycelial biomass of the two targeted truffle species (T. melanosporum and T. aestivum) was also positively influenced by the greater soil moisture conditions created beneath the white mulch treatment, where we have quantified the greatest mycelium of both species. However, at white mulch treatment and when both species co-occur in soil, T. melanosporum mycelial biomass was greater than T. aestivum under irrigated treatments, and the opposite at non-irrigated ones. No differences in mycelium biomass of the selected species was observed across the different habitats (wild vs plantations) and climate regions (Mediterranean vs temperate). However, the likelihood of finding T. melanosporum in the soil cores collected in Mediterranean areas was greater than in temperate regions, while T. aestivum seems to not have climate region preference. In addition, community analyses revealed that the fungal community composition was strongly affected by habitat (regardless the tree species) rather than climate region. Sampling season did not affect soil community composition, fungal biodiversity or fungal functional groups abundance. Greater ectomycorrhizal diversity values were observed in wild locations than in plantations sites. Instead, when the whole fungal community was analyzed, the greatest diversity values were observed in temperate sites. In addition, moulds were the only fungal functional group differing between plantation and wild sites, with greater abundance in the latest. Finally, our results revealed P. fluorescens bacteria as the best root growth promoting bacteria on Q. faginea seedlings and also, the bacteria that better improves the mycorrhization rates of T. melanosporum, with an increase of more than 10 % of truffle colonized root tips compared with control treatment. No effect of bacterial inoculation time was observed on mycorrhization rates neither on seedling root traits. In summary and based on this results, it can be concluded that (i) mycelial dynamics may shift under climate change, and drought-resistant tree species are more adapted to sustain a stable mycelial biomass. (ii) The possibility of cultivate T. melanosporum supported by the application of irrigation and white mulch in Mediterranean areas conditioned by summer drought. (iii) T. melanosporum is still the most frequent truffle species at its commonly associated Mediterranean locations than T. aestivum regarding the ongoing climate change and; the strong influence of ecological successional stage (early successional stage at plantations compared with late successional stage al wild areas) and the little effect of host tree species shaping soil microbial structure was observed. Finally, (iv) the co-inoculation of T. melanosporum and P. fluorescens bacteria could have potential application in commercial nurseries to improve both, mycorrhization rates and seedling root growth.