INTRODUCCIÓ
Els tumors malignes són la primera causa de mort als països desenvolupats. El càncer colorectal (CCR) és la neoplàsia del tub digestiu més freqüent. Es diagnostiquen 20.000 nous casos de CCR a Espanya a l'any, i afecta a un de cada 10.000 espanyols. Mostra una incidència creixent i suposa el 15% dels nous diagnòstics de càncer. Els esforços investigadors es centren en la prevenció i cerca de noves possibilitats terapèutiques.
Sembla evident el paper què els processos de proliferació, diferenciació i destrucció cel·lular juguen en el desenvolupament de les neoplàsies i en el disseny de futures estratègies diagnòstiques i terapèutiques.
Pocs articles en la literatura han demostrat interès per l'estudi de la proliferació cel·lular i la mort cel·lular programada de les lesions preneoplàsiques del còlon.
En la última dècada alguns treballs han investigat el paper que diversos oncogens, gens supressors de tumor, marcadors de proliferació cel·lular i inhibidors de la mateixa juguen en el desenvolupament de lesions canceroses a partir d'un pòlip adenomatós colorectal preexistent. De tots ells destaca per les seves possibles aplicacions diagnòstiques i terapèutiques els dedicats a l'estudi citomètric del contingut d'ADN en la seqüència adenoma-càncer colorectal, encara que la seva importància no ha estat demostrada de forma concloent. L'establiment definitiu del paper que juga la inhibició de l'apoptosi en l'esmentada seqüència podria condicionar el maneig clínic futur dels pacients amb pòlips adenomatosos colorectals.
Aquest treball pretén valorar de forma simultània la influència del contingut d'ADN i la inhibició de la mort cel·lular programada en la seqüència adenoma càncer colorectal, i fer una correlació d'ambdues amb variables clinicodemogràfiques i antomopatològiques.

HIPÒTESIS
1. L'estudi del contingut d'ADN i proliferació cel·lular per citometria de flux pot ser un indicador important per al diagnòstic precoç de transformació maligna dels pòlips colorectals.
2. El fracàs o inhibició de l'apoptosi pot conduir a la formació de pòlips colorectals i a la seva transformació maligna.

MATERIAL I MÈTODES
Estudio retrospectiu. Mostres: 134 vàlides obtingudes a partir de blocs parafinats procedents de pòlips colorectals extrets per polipectomia endoscòpica des de 1996 fins 2001 (22 adenomatosos, 94 tubulovellosos, 18 vellosos). En 33 pòlips es va detectar adenocarcinoma intramucós (16) o invasor (17). Controls: 128 biòpsies endoscòpiques de mucosa normal que es corresponen als quatre segments d'intestí gros (36 a còlon ascendent, 32 a còlon transvers, 31 a còlon descendent, 29 a recte-sigma).
Processament i anàlisi per citometria de flux del contingut d'ADN i fases del cicle cel·lular, amb tècnica de Hedley modificada. Contatge mitjançant un citòmetre de flux EPICS PROFILE I.
Estudi d'apoptosi: protocol de tinció sobre talls de 4 m amb el mètode TUNEL modificat; contatge cel·lular segons criteris predeterminats, i càlcul de l'índex d'apoptosi (IA).
Els resultats obtinguts es van correlacionar amb variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques.
En les mostres en les quals coincidien una porció adenomatosa i una altra neoplàsica en el mateix pòlip es van diferenciar ambdues seccions.

RESULTATS
-Mucosa normal: al recte-sigma vam trobar el menor índex de proliferació cel·lular (p<0,001) i en aquesta mateixa localització en el terç superior glandular és on existeix major índex d'apoptosi (p=0,009).

-Pòlips sense càncer focal: els pòlips amb diploidia són els que presenten major índex d'apoptosi (p=0,05). De forma global l'I.A. és major en la zona superior glandular i disminueix de forma progressiva fins a ser mínim en la zona inferior (p<0,001). La major distribució de l'apoptosi correspon a la zona superior dels pòlips amb displàsia moderada i a la zona inferior dels pòlips d'entre 1 i 2 cm. (p=0,02).

-Pòlips amb càncer focal: en menors de 65 anys presenten major índex d'apoptosi (p=0,02). De forma global el IA és major en la zona inferior (p=0,014).
No hi ha relació entre la distribució de l'apoptosi i les variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques tan en la porció adenomatosa com en la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal.
Al comparar la porció adenomatosa i la tumoral, el major índex de proliferació (major % fase S) correspon a la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal invasor (p=0,039); no hi ha diferències significatives en la distribució i l'índex d'apoptosi.
Els pòlips amb càncer focal intramucós amb histologia túbulo-vellosa són els que tenen major IA (p=0,035). En els pòlips amb càncer focal invasor els majors índexs d'apoptosi s'observen en els d'histologia túbulo-vellosa (p=0,03), grandària menor d'1cm (p=0,002) i menors de 65 anys (p=0,02).

-Comparació mucosa normal versus pòlips sense i amb càncer focal: el major índex de proliferació s'obté en el grup de pòlips amb càncer focal i els subgrups intramucós i invasor tan en les seves porcions adenomatoses com tumorals (p<0,001). L'índex d'apoptosi total, per zones, i la distribució de l'apoptosi per zones són majors en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001).

-Comparació mucosa normal versus pòlips sense càncer focal: els pòlips sense càncer focal tenen major índex de proliferació, essent una variable predictiva independent (p<0,001). La distribució de l'apoptosi per zones i l'índex d'apoptosi total i per zones també és major en els pòlips sense càncer focal però en aquest cas només té valor predictiu independent en els terços mig (p<0,001) i inferior (p=0,001).

-Comparació mucosa normal versus pòlips amb càncer focal: els pòlips amb càncer focal tenen major índex de proliferació, tan en la porció adenomatosa com tumoral, que el grup de mostres normals, amb valor predictiu independent (p=0,003).
La distribució i l'índex d'apoptosi, ambdós per zones, són majors en la zona superior del grup de mostres normals (p=0,007) i en la zona inferior del grup de pòlips amb càncer focal (p=0,007). Les esmentades variables tenen valor predictiu independent.

-Comparació pòlips adenomatosos versus pòlips amb càncer focal: els segons presenten major percentatge d'aneuploidia (p<0,001), sense diferències a l'índex de proliferació.
El IA total és superior en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001), de la mateixa manera que la distribució i IA en els terços superior i mig (p<0,001), amb valor predictiu independent tan si es considera la part adenomatosa com la part tumoral dels pòlips amb càncer focal. La menor apoptosi en el terç superior dels pòlips amb càncer focal pressuposa transformació maligna.
Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part adenomatosa dels pòlips amb càncer focal, les variables grandària major de 2 cm (p=0,027), displàsia severa (p=0,036) i presència d'aneuploidia (p=0,043) tenen valor predictiu independent, i suggereixen la presència de transformació maligna.
Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part tumoral dels pòlips amb càncer focal només les variables grandària major de 2 cm (p=0,017) i presència d'aneuploidia (p=0,005) tenen valor predictiu independent per indicar transformació maligna.

CONCLUSIONS
El major percentatge de cèl.lules en fase S junt amb l'aneuploidia constitueixen un indicador precoç, amb valor predictiu independent, de transformació maligna dels pòlips colorectals.
Els pòlips amb càncer focal, intramucós o invasor, presenten un índex d'apoptosi major en la zona inferior glandular, essent una variable amb valor predictiu independent de transformació maligna.
Les variables grandària > 2 cm., displàsia severa, aneuploidia i major índex d'apoptosi en la zona inferior glandular, totes elles amb valor predictiu independent, permeten diferenciar entre els pòlips amb i sense càncer focal.
La inhibició de l'apoptosi afavoreix el creixement dels pòlips colorectals així com la seva transformació maligna.

INTRODUCCIÓN
Los tumores malignos son la primera causa de muerte en los países desarrollados. El cáncer colorrectal (CCR) es la neoplasia más frecuente del tubo digestivo. Se diagnostican 20.000 nuevos casos de CCR en España cada año, y afecta a uno de cada 10.000 españoles. Muestra una incidencia creciente, y supone el 15% de los nuevos diagnósticos de cáncer. Los esfuerzos investigadores se centran en la prevención y la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas.
Parece evidente el papel que los procesos de proliferación, diferenciación y destrucción celular juegan en el desarrollo de las neoplasias y en el diseño de futuras estrategias diagnósticas y terapéuticas.
Pocos artículos en la literatura han demostrado su interés por el estudio de la proliferación celular y la muerte celular programada de las lesiones preneoplásicas del colon.
Durante la última década algunos trabajos investigan el papel que diversos oncogenes, genes supresores de tumor, marcadores de proliferación celular e inhibidores de la misma juegan en el desarrollo de lesiones cancerosas a partir de un pólipo adenomatoso colo-rectal preexistente. De todos ellos destacan por sus posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas los dedicados al estudio citométrico del contenido de ADN celular en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, aunque su importancia no se ha demostrado de forma concluyente. El establecimiento definitivo del papel que juega la inhibición de la apoptosis en dicha secuencia podría también condicionar el manejo clínico futuro de los pacientes afectos de pólipos adenomatosos colo-rectales.
El presente trabajo pretende valorar de forma simultánea la influencia del contenido de ADN celular y la inhibición de la muerte celular programada en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, correlacionando ambaos con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.

HIPÓTESIS
1. El estudio del contenido de ADN y proliferación celular por citometría de flujo puede ser un indicador importante para el diagnóstico precoz de transformación maligna de los pólipos colorrectales.
2. El fracaso o inhibición de la apoptosis puede conducir a la formación de pólipos colorrectales así como a su transformación maligna.

MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio retrospectivo. Muestras: 134 válidas obtenidas a partir de bloques parafinados procedentes de pólipos colorrectales extraídos por polipectomía endoscópica desde 1996 hasta 2001 (22 adenomatosos, 94 túbulo-vellosos, 18 vellosos). En 33 pólipos se detectó adenocarcinoma intramucoso (16) o invasor (17). Controles: 128 biopsias endoscópicas de mucosa normal correspondientes a los cuatro segmentos de intestino grueso (36 a colon ascendente, 32 a colon transverso, 31 a colon descendente, 29 a recto-sigma).
Procesado y análisis mediante citometría de flujo del contenido de ADN y fases del ciclo celular, con técnica de Hedley modificada. Contaje mediante un citómetro de flujo EPICS PROFILE I.
Estudio de apoptosis: protocolo de tinción sobre cortes de 4 m con método TUNEL modificado; contaje celular siguiendo criterios predeterminados, y cálculo del índice de apoptosis (IA).
Los resultados obtenidos se correlacionaron con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.
En las muestras en las que una porción adenomatosa y otra neoplásica coincidían en el mismo pólipo se diferenciaron ambas secciones.

RESULTADOS
-Mucosa normal: en recto-sigma encontramos el menor índice de proliferación celular (p<0,001) y en esa misma localización en el tercio superior glandular es donde existe mayor índice de apoptosis (p=0,009).

-Pólipos sin cáncer focal: los pólipos con diploidia son los que presentan mayor índice de apoptosis (p=0,05). Globalmente el I.A es mayor en la zona superior glandular y disminuye de forma progresiva hasta ser mínimo en la zona inferior (p<0,001). La mayor distribución de la apoptosis corresponde a la zona superior de los pólipos con displasia moderada y a la zona inferior de los pólipos de entre 1 y 2 cm. (p=0,02).

-Pólipos con cáncer focal: en menores de 65 años presentan mayor índice de apoptosis (p=0,02). Globalmente el IA es mayor en la zona inferior (p=0,014).
No hay relación entre la distribución de la apoptosis y las variables clínico-demográficas y anatomopatológicas tanto en la porción adenomatosa como en la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal.
Al comparar entre sí la porción adenomatosa y la tumoral, el mayor índice de proliferación (mayor % fase S) corresponde a la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal invasor (p=0,039); no hay diferencias significativas en la distribución y el índice de apoptosis.
Los pólipos con cáncer focal intramucoso con histología túbulo-vellosa son los que tienen mayor IA (p=0,035). En los pólipos con cáncer focal invasor los mayores índices de apoptosis se observan en aquellos con histología túbulo-vellosa (p=0,03), tamaño menor de 1cm (p=0,002) y menores de 65 años (p=0,02).

-Comparación mucosa normal versus pólipos sin y con cáncer focal: el mayor índice de proliferación se obtiene en el grupo de pólipos con cáncer focal y los subgrupos intramucoso e invasor tanto en sus porciones adenomatosas como tumorales (p<0,001). El índice de apoptosis total, por zonas, y la distribución de la apoptosis por zonas son mayores en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001).

-Comparación mucosa normal versus pólipos sin cáncer focal: los pólipos sin cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, siendo ésta una variable predictiva independiente (p<0,001). La distribución de la apoptosis por zonas y el índice de apoptosis total y por zonas también es mayor en los pólipos sin cáncer focal pero en este caso sólo tienen valor predictivo independiente en los tercios medio (p<0,001) e inferior (p=0,001).

-Comparación mucosa normal versus pólipos con cáncer focal: los pólipos con cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, tanto en porción adenomatosa como tumoral, que el grupo de muestras normales, con valor predictivo independiente (p=0,003).
La distribución y el índice de apoptosis, ambos por zonas, son mayores en la zona superior del grupo de muestras normales (p=0,007) y en la zona inferior del grupo de pólipos con cáncer focal (p=0,007). Dichas variables tienen valor predictivo independiente.

-Comparación entre pólipos adenomatosos versus pólipos con cáncer focal: los segundos presentan mayor porcentaje de aneuploidia (p<0,001), sin diferencias en cuanto al índice de proliferación.
El IA total es superior en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001), al igual que la distribución e IA en los tercios superior y medio (p<0,001), con valor predictivo independiente tanto si se considera la parte adenomatosa como la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal. La menor apoptosis en el tercio superior de los pólipos con cáncer focal presupone transformación maligna.
Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte adenomatosa de los pólipos con cáncer focal, las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,027), displasia severa (p=0,036) y presencia de aneuploidia (p=0,043) tienen valor predictivo independiente, sugiriendo la presencia de transformación maligna.
Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal sólo las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,017) y presencia de aneuploidia (p=0,005) tienen valor predictivo independiente para indicar transformación maligna.

CONCLUSIONES
El mayor porcentaje de células en fase S junto con la aneuploidia constituyen un indicador precoz, con valor predictivo independiente, de transformación maligna de los pólipos colorrectales.
Los pólipos con cáncer focal, intramucoso o invasor, presentan un índice de apoptosis mayor en la zona inferior glandular, convirtiéndose en una variable con valor predictivo independiente de transformación maligna.
Las variables tamaño > 2 cm., displasia severa, aneuploidia y mayor índice de apoptosis en la zona inferior glandular, todas ellas con valor predictivo independiente, permiten diferenciar entre los pólipos con y sin cáncer focal.
La inhibición de la apoptosis favorece el crecimiento de los pólipos colorrectales así como su transformación maligna.

INTRODUCTION
Malignant tumors are the first cause of death in developed countries. Colon cancer is the most frecuent tumor of digestive tract. 20.000 colorectal cancer new cases are diagnosed in Spain every year and the problem involves one over 10.000 people. Colonic cancer shows and increasing incidence and causes about 15% of new diagnostics of tumor. Investigation efforts are focused on prevention and discovery of new treatment lines.
Cell proliferation, differentiation and destruction mechanisms are fundamental for tumor growth and for development of new diagnostic and therapeutic methods.
A few works have shown interest in the study of cellular proliferation and programmed cellular death mechanisms in preneoplasic colonic injures.
During last decade some works tried to find out the paper that oncogenes, tumor growth supressor genes, cell growth proliferation markers and inhibitors issues have in the outcome of malignant injures on a previous adenomatous colorectal polyp. Of all of them, those measuring cellular DNA content by flow cytometry in the colorectal adenoma- colorectal cancer secuence are important because of their diagnostic and therapeuthic applications, but they-re not conclusive. To stablish definitly the paper of apoptosis inhibition in that process could conditioning the clinical practise on the patient with adenomatous colo-rectal polyps in the future.
The present study pretends measuring both the influence of cellular-DNA content and the programmed cellular death on the adenoma-colorectal cancer secuence, and their correlation with clinical, demographical and anatomopathological items.

HYPOTHESIS
1. The study of DNA content and cell proliferation rate measured by flow citometry can be a good indicator of malignant tranformation in colonic polyps.
2. Apoptosis inhibition can induce colonic polyps´ growth and their malignant tranformation.

MATERIAL AND METHODS
Retrospective study. Specimens: 134 colorectal polyps obtained by endoscopic polypectomy between 1996 and 2001 (22 adenomatous, 94 tubulovillous and 18 villous polyps). Controls: 128 specimens obtained by endoscopical resection of normal mucosa in colonic tract (36 in ascending colon, 32 in transverse colon, 31 in descending colon and 29 in sigmoid colon and rectum).
Specimens were prepared using a modification of the method described by Hedley et al. and DNA content was messured by flow analysis. Flow citometry was carried out on EPICS PROFILE I cell sorter.
Identification of apoptosis: 4 m slides of tissue samples were treated with a modification of TUNEL method. We described the labeling pattern and apoptosis index.
Obtained results were related to clinical-demographical and histopathological items.
When adenomatous and malignant sections were found together in the same polyp sample, both of them were treated as independent sections.




RESULTS
-Normal mucosa: the lowest cell proliferation index is found in rectal and sigmoid location. There, in the upper crypt section we found the higher apoptosis index (p=0,009).

-Non malignant polyps: diploid polyps present the highest apoptosis index (p=0,005). Apoptosis index is higher in upper crypt section and it decrease to be minimun in lower crypt section (p>0,001). Apoptotic cells are mainly located in the upper zone of mild displasic polyps and lower zone of polyps being between 1 and 2 cm sized (p=0,02).

-Malignant polyps: apoptosis index is higher in people being under 65 year-old (p=0,02) and in lower crypt section (p=0,014). It doesn-t exist a relation between apoptosis distribution and clinical, demographical or anatomopathological items nor in the adenomatous or the tumoral sections of malignant polyps.
Malignant section in malignant polyps shows the highest proliferation rate (p=0,039), if we compare adenomatous and malignant sections. It doesn´t exist a significative difference on apoptosis distribution or index. Intramucosal malignant tubulovillous polyps show the higher AI (p=0,035).

-Comparison between normal mucosa and polyps: the highest proliferation index is obtained in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps (p<0,001). Apoptosis index and apoptotic cells rate are higher in non malignant polyps (p<0,001).

-Comparison between normal mucosa and non malignant polyps: non malignant polyps have a higher proliferation rate with an independent predictive value (p<0,001). Apoptotic cells rate and apoptosis index is higher in non malignant polyps. Both of them have independent predictive value when messured in medium (p<0,001) and lower (p=0,001) crypt sections.

-Comparison between normal mucosa and malignant polyps: malignant polyps have higher proliferation index than normal mucosa, in both adenomatous and tumoral sections with an independent predictive value (p=0,003).
Apoptosis distribution and index are higher in the upper crypt section of normal mucosa (p=0,007) and in the lowest crypt section of malignant polyps (p=0,007); both of them with independent predictive value.

-Comparison between adenomatous polyps and malignant polyps: malignant polyps present higher aneuploidy rate (p<0,001) with no differences in proliferation rate. AI is higher in non malignant polyps (p<0,001) as well as apoptotic cells rate and AI in upper ad medium crypt sections (p<0,001) with independent predictive value, both in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps. The lowest apoptosis rate is found in upper crypt section in malignant polyps and it correlates with potencial malignant transformation .
If we compare non malignant polyps and adenomatous section of malignant polyps, the items size higher than 2 cm (p=0,027), severe displasia (p=0,036) and aneuploidy (p=0,043) have independent predictive value showing a malignant transformation.
If we compare non malignant polyps and neoplasic section of malignant polyps, only size higher than 2cm (p=0,017) and aneuploidy (p=0,005) have independent predictive value to shown a malignant transformation.


CONCLUSIONS
Higher cell proliferation rate and aneuploidy are a predictive item of malignant transformation in colorectal polyps, with independent value.
Lower crypt section in malignant polyps presents a higher apoptosis index, with independent predictive value, showing malignant transformation.
Items size higher than 2 cm, severe displasia, aneuploidy and higher apoptosis index in lower crypt section, all of them with independent predictive value, are useful to discriminate between malignant and no malignant polyps.
Apoptosis inhibition promoves growing in colorectal polyps, as well as their malignant transformation.