Potencial de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem para la detección, cuantificación y confirmación de fármacos en aguas

Autor/a

Gracia Lor, Emma

Director/a

Hernández Hernández, Félix,

Sancho Llopis, Juan Vicente

Data de defensa

2013-06-24

Pàgines

387 p.



Departament/Institut

Universitat Jaume I. Departament de Química Física i Analítica

Resum

Los fármacos son probablemente los contaminantes emergentes que en losúltimos años han suscitado un mayor interés debido a que su presencia en el medioambiente puede afectar a la calidad del agua y a los organismos vivos. Tras su consumohumano y/o veterinario, los fármacos pueden excretarse sin sufrir ningunamodificación o bien en forma de metabolitos, llegando a alcanzar concentracionesimportantes en las aguas residuales urbanas. Los tratamientos aplicados en la mayoríade las estaciones depuradoras de aguas residuales no son suficientes para eliminarloscompletamente, con lo que finalmente llegan al medio acuático. Se requiere puesmetodología analítica que permita determinar de modo fiable los fármacos y susmetabolitos en el medio acuático para poder evaluar sus posibles efectos negativossobre el medio ambiente.En esta Tesis se ha estudiado el potencial analítico y las aplicaciones delacoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem(LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) y con analizador híbridocuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de fármacos y de susmetabolitos/productos de transformación aguas de distinta naturaleza.El trabajo realizado se ha dividido en dos partes. En primer lugar, se haestudiado el potencial del acoplamiento UHPLC-MS/MS para la determinacióncuantitativa de fármacos. Se han desarrollado tres métodos multirresiduales basados enuna etapa de tratamiento de muestra mediante SPE y posteriormente determinaciónpor UHPLC-MS/MS con triple cuadrupolo. En todos ellos se han determinadosimultáneamente compuestos pertenecientes a distintas familias de fármacos, conpropiedades físico-químicas muy diversas, en una única inyección; es decir, sedeterminan simultáneamente los compuestos que se ionizan en modo positivo y enmodo negativo.En el primer método se seleccionaron los 20 fármacos más consumidos enEspaña. Se analizaron compuestos como ibuprofeno, diclofenaco, atorvastatina,omeprazol, alprazolam, entre otros. Posteriormente, esta lista de compuestos se amplió notablemente mediante la incorporación de aproximadamente 30 antibióticos, dandocomo resultado el método presentado en el segundo trabajo. La elección de estoscompuestos se basó fundamentalmente en los posibles efectos negativos que puedenocasionar en los organismos vivos y en el medio acuático. Ambos métodos fueronoptimizados y validados tanto en agua superficial como en aguas residuales urbanas.Ambas metodologías se aplicaron al análisis de muestras de influentes y de efluentescon el fin de estudiar la presencia de los fármacos seleccionados, así como su posibleeliminación en estaciones depuradoras de aguas urbanas situadas en la provincia deCastellón en las que se utilizan tratamientos convencionales. Destacó la presencia delos analgésicos/antiinflamatorios y los fármacos utilizados para el tratamiento delcolesterol y los antibióticos pertenecientes al grupo de las quinolonas. En cuanto alcomportamiento de los fármacos durante el proceso de tratamiento, se pudo diferenciarentre aquellos compuestos que se eliminaron completamente, un grupo mucho másnumeroso formado por analitos cuya eliminación fue incompleta y un último grupoconstituido por aquellos compuestos que únicamente se detectaron en las muestras deefluente.La primera parte de esta Tesis finaliza con un tercer método para el análisis defármacos seleccionados y productos de cuidado personal. El interés por este último tipode compuestos ha aumentado en los últimos años, motivo por el cual se decidióincorporarlos a la lista de contaminantes objeto de estudio. En todos los trabajosrealizados, pero especialmente en éste, se puso especial interés en la evaluación delefecto matriz en diferentes tipos de agua para la correcta cuantificación de los analitos.Se realizó un estudio en profundidad de la eficacia del proceso de extracción por SPE ydel efecto matriz en 10 muestras de agua diferentes. El método se validó así mismo envarios tipos de aguas superficiales y de efluentes con el objetivo de afrontar diferentescomposiciones de matriz y situaciones reales que pueden aparecer cuando se analizanmuestras de agua. Finalmente, en un estudio colaborativo con la Universidad deAntioquia, Medellín, se analizaron 73 muestras (aguas superficiales y efluente)recogidas en España y en Colombia. En este último caso, las muestras procedían de dosembalses utilizados para el abastecimiento de agua potable y tan sólo se detectaronproductos de cuidado personal. La presencia de estos compuestos también resultó destacable en las aguas superficiales recogidas en la Comunidad Valenciana. En ellastambién se hallaron también casi todos los fármacos seleccionados. En el caso de lasaguas de efluente, aproximadamente el 65% de los compuestos se detectaron en todaslas muestras. Cabe destacar los elevados niveles de concentración de los fármacosanalizados, a diferencia de los compuestos de cuidado personal cuyos niveles deconcentración resultaron más bien bajos.La segunda parte de la Tesis se centra en la investigación demetabolitos/productos de transformación de fármacos en aguas. Esta línea deinvestigación se inició porque algunos fármacos analizados en los primeros trabajos nose habían detectado en ninguna de las muestras. Llamó especialmente la atención en elcaso de fármacos que se habían seleccionado por su elevado consumo. Por ello, sedecidió investigar la presencia de sus metabolitos y/o productos de transformación enlas aguas. Además, la información que existe actualmente acerca de la presencia de losmetabolitos de fármacos en el medio ambiente y de sus posibles efectos es escasa, apesar de que estos compuestos deberían tenerse en consideración ya que unaexposición prolongada podría tener efectos indeseados similares a los de los fármacos.En primer lugar, se estudió el potencial del acoplamiento UHPLC-QTOF MS enla investigación de aproximadamente 160 metabolitos/TPs, reportados en labibliografía, en muestras de efluente en las que previamente se habían detectadodiversos fármacos (análisis retrospectivo). Los análisis se realizaron utilizando el modode trabajo MSE, que implica la adquisición simultánea de dos funciones a diferentesenergías de colisión (alta y baja energía) y permite adquirir simultáneamenteinformación sobre el ión molecular y sus iones fragmento en una única inyección. Laevaluación retrospectiva permitió la detección e identificación de cuatro metabolitos,en concreto, N-desmetil claritromicina y 14-hidroxi-claritomicina, ambos metabolitosde la claritromicina, ácido fenofíbrico y ácido carboxílico de clopidogrel, metabolitosdel fenofibrato y de clopidogrel respectivamente.Por otro lado, la elevada resolución y exactitud de masa del QTOF permitióresolver una situación problemática observada en análisis previos realizados por LCResumenMS/MS (QqQ), que habían dado lugar a falsos positivos de uno de los metabolitos delfármaco dipirona (4-AA). El uso de la alta resolución nos ayudó a descubrir la presenciade otros dos metabolitos de la dipirona que compartían las mismas transiciones,complicando de este modo la correcta identificación de los compuestos. Además, esteestudio sirvió para resaltar la importancia que tiene la separación cromatográfica ensituaciones problemáticas en las que los metabolitos de un compuesto puedencompartir las mismas transiciones. En el caso de la dipirona, los metabolitosdescubiertos por QTOF, que compartían las mismas transiciones que el previamenteanalizado 4-AA, fueron el 4-formilaminoantipirina (4-FAA) y 4-acetamidoantipirina (4-AAA). Aunque con una estructura química y fórmula molecular diferentes, ambossufrieron fragmentación en la fuente electrospray, dando lugar al 4-AA, que fue elcompuesto reportado en los análisis realizados mediante UHPLC-MS/MS.Finalmente, se desarrolló un método basado en UHPLC-MS/MS para ladeterminación cuantitativa de varios metabolitos identificados mediante QTOF.Además, se seleccionaron otros metabolitos reportados en las aguas según labibliografía, y se incluyeron también sus fármacos de partida. El método se validó enagua superficial y de efluente. En este último caso, gracias a la elevada sensibilidad delmétodo se pudo corregir el efecto matriz mediante una simple dilución de las muestras(x4). De los 21 compuestos analizados, tan sólo tres (ácido clofíbrico, enalaprilato yomeprazol) no se hallaron en ninguna de las muestras. Esta información demuestra laimportancia que tiene la inclusión de los metabolitos/TPs en los métodosmultirresiduales, ya que se detectan con elevada frecuencia en las aguas y, enocasiones, a concentraciones superiores a las de los propios fármacos.


Pharmaceuticals are among the emerging contaminants that have caused agreater interest in the last years because of their presence in the environment can affectthe water quality and living organisms. After their human and/or veterinaryconsumption, pharmaceuticals can be excreted in unchanged form as the parentcompound and/or as metabolites, reaching high concentrations in urban wastewaters.Treatment processes applied in most wastewater treatment plants are not efficientenough to remove pharmaceuticals completely, which can eventually reach the aquaticenvironment. Therefore, analytical methodology is required to determinepharmaceuticals and their metabolites in the aquatic ecosystem in a reliable way toevaluate their potential negative effects on the environment.In this Thesis the analytical potential and applications of liquid chromatographyand tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with triple quadrupole (QqQ) and hybridquadrupole-time of flight (QTOF) analyzers in the determination of pharmaceuticalsand their metabolites/transformation products in different types of waters has beenstudied.The work done has been divided in two parts. Firstly, the potential of thecoupling UHPLC-MS/MS has been explored for the quantitative determination ofpharmaceuticals. Three multi-residue methods based on a pre-treatment step by solidphaseextraction followed by UHPLC-MS/MS determination with triple quadrupolehave been developed. In all of them, compounds belonging to different pharmaceuticalgroups, with very diverse physico-chemical characteristics have been determined in asingle injection, i.e, positive and negatively ionized compounds are simultaneouslydetermined in a single analysis.In the first method, the 20 most consumed pharmaceuticals in Spain wereselected. Compounds such as ibuprofen, diclofenac, atorvastatin, omeprazol,alprazolam, among others, were analyzed. Later, this list of compounds was notablyenlarged by the addition of around 30 antibiotics, resulting in the method presented inthe second work. These compounds were mainly selected due to their potential negativeSummaryeffects on living organisms and on the aquatic environment. Both methods wereoptimized and validated in surface waters and in urban wastewaters. Subsequently,both methodologies were applied to the analysis of influent and effluent wastewaters inorder to study the presence of selected pharmaceuticals, as well as their possibleremoval, in urban wastewater treatment plants located in the Castellon province whereconventional treatments are applied. Analgesics/anti-inflammatories and compoundsused to lower cholesterol levels and quinolone antibiotics were the most frequentlydetected pharmaceuticals. Regarding their behaviour during the treatment process, wecould distinguish among those compounds completely removed, a numerous groupformed by the analytes that were partially removed, and a last group includingcompounds that were only detected in the effluent wastewater samples.The first part of Thesis ends with a third method developed for the analysis ofselected pharmaceuticals and personal care products. The interest regarding the lastfamily of compounds has increased in the last years, therefore they were included in thelist of contaminants under study. In all the works carried out, but mainly in this one,special interest was paid on the evaluation of matrix effects in different types of waterfor the correct quantification of the analytes. A detailed study of the extraction processefficiency and matrix effect was carried out in 10 different water samples. The methodwas validated in several types of surface waters and effluents in order to evaluatedifferent matrix compositions and real situations that can appear when real-worldwater samples are analyzed. Finally, in a collaborative study with the AntioquiaUniversity, (Medellin) 73 samples (surface and effluent) collected in Spain andColombia were analyzed. In the last case, the samples were collected from tworeservoirs used for drinking water supply and only personal care products weredetected. The presence of these compounds was also remarkable in the surface watersamples collected in the Valencian Community (Spain). In these samples, almost all thetarget pharmaceuticals included in the method were found. In the case of effluentwastewater samples, approximately 65% of the compounds were detected in all thesamples. It is important to remark the high concentration levels found for somepharmaceuticals, in contrast to the personal care products which concentrations wererather low.SummaryThe second part of the Thesis is focused on the investigation of pharmaceuticalmetabolites/transformation products in waters. This research was made because someof the pharmaceuticals selected in the first works were never detected in any of thesamples analyzed. It was especially surprising in the case of pharmaceuticals highlyconsumed. So, we decided to study the presence of their metabolites and/ortransformation products in water. Moreover, the information currently availableregarding the presence of pharmaceutical metabolites in the environment and theirpossible effects is scarce, despite these compounds are also of concern as a longexposition may have undesirable effects similar to those of the parent pharmaceuticals.Firstly, the potential of UHPLC-QTOF MS has been evaluated in theinvestigation of around 160 metabolites/TPs, reported in the bibliography, in effluentwastewater samples where several pharmaceuticals had been previously detected(retrospective analysis). Analyses were made in MSE mode, which involves thesimultaneous acquisition of two functions at different collision energies (low and high).This allows acquiring simultaneously information about the molecular ion and thefragment ions in a single injection. The retrospective evaluation allowed the detectionand identification of four metabolites, such as N-desmethyl clarithromycin and 14-hydroxy-clarithromycin, both metabolites of clarithromycin, fenofibric acid andclopidogrel carboxylic acid, metabolites of fenofibrate and clopidogrel, respectively.On the other hand, the high resolution and exact mass measurements of theQTOF allowed to solve a problematic situation observed in previous analysis by LCMS/MS (QqQ), which had led to false positives of one of the metabolites (4-AA) of thepharmaceutical dipyrone. The use of high resolution helped us to discover the presenceof two other dipyrone metabolites that shared the same transitions, complicating theright identification of the compounds. Moreover, this study was useful to highlight theimportance of the chromatographic separation in problematic situations where themetabolites of a compound can share the same transitions. In the case of dipyrone, themetabolites discovered by QTOF, that showed the same transitions than the previouslyanalyzed 4-AA, were 4-formilaminoantipyrine (4-FAA) and 4-acetamidoantipyrine (4-AAA). Although they have different chemical structure and molecular formula, bothSummarysuffered in-source fragmentation in the electrospray source, producing 4-AA, thecompound that had been reported in the analysis carried out by UHPLC-MS/MS.Finally, a method based on UHPLC-MS/MS was developed for the quantitativedetermination of several metabolites identified by QTOF. Moreover, other metabolitesdetected in waters according to the consulted bibliography, as well as their parentcompounds were also included. The method was validated in surface and effluentwastewater. In this last case, the high sensitivity of the method allowed to correctmatrix effects by a simply 4-fold dilution of the samples. Only 3 out of 21 compoundsanalyzed (clofibric acid, enalaprilate and omeprazole) were not found in any of thesamples. Our data showed the importance of including pharmaceuticalmetabolites/TPs in the multi-residue methods, as they are frequently detected inwaters and, sometimes, at concentrations higher than their parent compounds.

Paraules clau

Cromatografía de líquidos; Liquid chromatography; Espectrometría de masas; Mass spectrometry; Fármacos; Drugs; Contaminación; Water pollution

Matèries

54 - Química

Documents

2013_Gracia_Lor_Emma.pdf

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