Effect of microstructural and chemical cues on the in vitro cell response to calcium phosphates

Abstract

Bone has a natural ability to regenerate. However, it cannot bridge large defects without the additional help of a supporting material. Among the different synthetic bone grafts, calcium phosphates (CaPs) are excellent candidates for bone regeneration due to their close resemblance to the mineral phase of bone, as well as the bioactive and osteoinductive potential. The present thesis explores the effect of the physicochemical features of CaPs on the interaction with the cells involved in the different stages of the bone healing process: inflammation, angiogenesis and osteogenesis, paying special attention to biomimetic calcium deficient hydroxyapatite (CDHA). This is analysed through in vitro cell cultures with immune, endothelial and bone forming cells, respectively. An overview of bone biology and bone healing process is presented in Chapter 1. Moreover, the Chapter 1 describes synthetic bone grafts based on CaPs and the impact of their physicochemical features on cellular behaviour in vitro. Chapter 2 and Chapter 3 study the response of immune cells to calcium phosphates and its outcome on osteogenic differentiation of bone forming cells. Specifically, Chapter 2 explores the link between nanotopography, specific surface area and porosity of biomimetic CDHA and its immunomodulatory, osteoimmunomodulatory and antinflammatory features, demonstrating that neddle- like topography of CDHA stimulated the osteogenic activity of bone forming cells, whilst a reduction of porosity to CDHA substrates decreased the inflammatory state. Chapter 3 is devoted to study the interaction of two chemically and texturally different calcium phosphates i.e. biomimetic CDHA and sintered ß-tricalcium phosphate (ß-TCP) with macrophages under inflammatory environment and its further impact on osteogenic differentiation of mesenchymal (MSCs) and osteoblastic cells. Angiogenesis ensures the availability of oxygen and nutrients and controls the recruitment and osteogenic differentiation of bone forming cells, being one of the crucial processes during bone healing. Chapter 4 explores the interaction of two texturally different CDHA, i.e. needle-like and plate-like structured surfaces, as well as ß-TCP with endothelial progenitor cells (EPCs). Moreover, the cellular crosstalk between EPCs and MSCs is investigated by performing co-culture studies. Finally, the independent effect of surface chemistry and ionic exchange of sintered and biomimetic calcium phosphates on osteogenesis are explored in Chapter 5 and Chapter 6. Chapter 5 describes the response of MSCs and osteoblastic cells to biommimetic CDHA and sintered CaPs i.e. ß-TCP, a-tricalcium phosphate (a-TCP) and hydroxyapatite (HA). The results showed that the direct contact with substrate is required to induce the osteogenic differentiation of both MSCs and osteoblasts. Moreover, the culture with the CDHA resulted in greater upregulation of ALP secretion for both cell types suggesting osteoinductive capacity of this substrate. Nonetheless, MSCs proliferation was impaired both in direct and indirect cultures on CDHA, suggesting that the increased ionic fluctuations, triggered by high SSA and calcium deficiency of the substrate, were responsible for this scenario. Hence Chapter 5 revealed the complexity to assess the cell-material interactions of highly reactive substrates in static in vitro cultures. This is further explored in Chapter 6, where a strategy is proposed to analyse the parameters affecting the response of MSCs to CDHA. The approach consisted of adjusting the volume ratio between the cell culture medium and CaP substrate, which allowed mitigating the drastic ionic changes. The results demonstrated that the alterations of calcium and phosphate concentrations impaired cell adhesion by reducing the number of focal adhesions, this leading to cell shrinkage and apoptosis. On the contrary, when the ionic fluctuations were attenuated, MCSs spread, proliferated and differentiated over time.

El hueso tiene una capacidad natural para regenerarse. Sin embargo, no puede restaurar grandes defectos sin la ayuda adicional de un material de soporte. Entre los distintos injertos óseos sintéticos, los fosfatos de calcio son excelentes candidatos para la regeneración ósea debido a su gran parecido con la fase mineral del hueso, así como también a su potencial bioactivo y osteoinductor. La presente tesis explora el efecto de las características fisicoquímicas de los fosfatos de calcio en la interacción con las células involucradas en las diferentes etapas del proceso de regeneración ósea, es decir, inflamación, angiogénesis y osteogénesis, prestando atención especial a la hidroxiapatita biomimética deficiente en calcio (CDHA). Dicho efecto se analiza mediante el cultivo celular in vitro de células inmunológicas, endoteliales y formadoras del hueso, respectivamente. En el Capítulo 1 se presenta una descripción general de la biología ósea y el proceso de regeneración ósea. Además, el Capítulo 1 describe el estado del arte respecto a los injertos óseos basados en fosfatos de calcio y el impacto de sus características fisicoquímicas en el comportamiento celular in vitro. En el Capítulo 2 y el Capítulo 3 se estudia la respuesta de las células inmunológicas a los fosfatos de calcio y su implicación en la diferenciación osteogénica de las células formadoras de hueso. Específicamente, el Capítulo 2 explora el vínculo entre la nanotopografía, la superficie específica (SSA) y la porosidad de la CDHA biomimética y sus características inmunomoduladoras, osteoinmunomoduladoras y antiinflamatorias, demostrando que la CDHA con topografía en forma de aguja estimuló la actividad osteogénica de las células formadoras de hueso, mientras que una reducción en la porosidad de los sustratos CDHA resultó en una disminución del estado inflamatorio. El Capítulo 3 está dedicado a estudiar la interacción de dos fosfatos de calcio químicamente y texturalmente diferentes, es decir, la CDHA biomimética y el fosfato tricálcico beta (β-TCP), con macrófagos bajo un ambiente inflamatorio y su repercusión en la diferenciación osteogénica de las células mesenquimales (MSC) y osteoblásticas. La incubación con β-TCP dio como resultado una disminución en la liberación de moléculas proinflamatorias en las células inmunológicas, mientras que la interacción entre los macrófagos y la CDHA llevó a un entorno más favorable para la diferenciación osteogénica de las células formadoras de hueso. La angiogénesis asegura la disponibilidad de oxígeno y nutrientes y controla el reclutamiento y la diferenciación osteogénica de las células formadoras del hueso, siendo uno de los procesos cruciales durante la regeneración ósea. El Capítulo 4 explora la interacción de dos CDHA texturalmente diferentes, es decir, con superficie en forma de aguja o placa, además del β-TCP con células endoteliales progenitoras (EPCs). Asimismo, se investiga la interacción celular entre células endoteliales progenitoras y células mesenquimales realizando estudios de cocultivo. En general, la expresión de genes relacionados con procesos de angiogénesis en el monocultivo de ECPs fue más pronunciada para la CDHA con topografía en forma de aguja. Además, se demostró la comunicación celular mediante la regulación positiva de los genes relacionados con la osteogénesis, siendo este comportamiento especialmente pronunciado para la CDHA con microestructura en forma de aguja. Finalmente, el efecto independiente de la química y del intercambio iónico de los fosfatos de calcio, tanto sinterizados como biomiméticos, sobre la osteogénesis se explora en el Capítulo 5 y Capítulo 6. El Capítulo 5 describe la respuesta de las MSCs y las células osteoblásticas a la CDHA biomimética y a tres cerámicas sinterizadas, es decir, β-TCP, fosfato tricálcico alfa (α-TCP) e hidroxiapatita (HA). Las células se cultivaron directamente sobre los biomateriales o indirectamente sobre un cubreobjetos de vidrio colocado sobre los sustratos, para exponer las células a los efectos exclusivos de los cambios iónicos inducidos por los CaPs sin el efecto adicional de la topografía. Los resultados mostraron que se requiere el contacto directo con el sustrato para inducir la diferenciación osteogénica de las MSCs y los osteoblastos. Además, el cultivo con la CDHA dio como resultado una mayor secreción de ALP para ambos tipos de células, lo que sugiere una gran capacidad osteoinductora de este sustrato. De todos modos, la proliferación de MSCs se vio afectada tanto en el cultivo directo como indirecto en la CDHA, lo que sugiere que las fluctuaciones iónicas, causadas por la elevada superficie específica y la deficiencia de calcio del sustrato, provocaron este comportamiento. Los resultados demostraron que la muerte celular fue inducida a través de la vía apoptótica. Por lo tanto, el Capítulo 5 reveló la complejidad de la evaluación de las interacciones célula-sustrato en cultivos estáticos in vitro en los biomateriales que presentan una alta reactividad iónica. Esa complejidad se explora más a fondo en el Capítulo 6, donde se propone una estrategia para analizar los parámetros que afectan la respuesta de las MSCs a la CDHA separadamente. El enfoque consistió en ajustar la relación de volumen entre el medio de cultivo celular y el volumen del sustrato de CaP permitiendo, de esa manera, mitigar los cambios iónicos drásticos. Los resultados demostraron que las alteraciones en las concentraciones de calcio y fosfato afectaron la adhesión celular reduciendo el número de adhesiones focales y el área celular, llevando finalmente a la muerte celular por apoptosis. En cambio, cuando las fluctuaciones iónicas fueron atenuadas, se observó como las MSCs se extendieron, proliferaron y diferenciaron a lo largo del tiempo. Además, el contacto con la CDHA dio lugar a una expresión más temprana de genes relacionados con la osteogénesis como la fosfatasa alcalina (ALP), la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) y la osteopontina (OPN) en comparación con el β-TCP, lo que sugiere un mayor potencial osteogénico de la CDHA biomimética.