DNA-based assays and biosensors for the detection of toxic microalgae and viruses in the marine environment

Abstract

L’objectiu d’aquesta tesi és contribuir al desenvolupament i a l’aplicabilitat d’assaigs i biosensors basats en ADN per a la detecció de microalgues (i.e. Karlodinium i Ostreopsis) i virus (i.e. herpesvirus de l’ostra) tòxics d’origen marí, així com contribuir a altres etapes del procés analític, com són el pretractament de la mostra i l’extracció de l’ADN. Aquestes noves eines inclouen assajos per qPCR, assajos colorimètrics, biosensors electroquímics i estratègies de captura basades en l’ús de partícules magnètiques. Es descriu un assaig de qPCR combinat amb un mètode d’extracció d’ADN ràpid i senzill per a la detecció de Karlodinium. La varietat d’assaigs colorimètrics i biosensors electroquímics que es presenten per a la detecció d’espècies de Karlodinium, Ostreopsis i herpesvirus de la ostra exploten la tècnica d’amplificació isotèrmica mitjançant la recombinasa i polimerasa (RPA, recombinase polymerase amplification), encebadors modificats amb cues d’àcids nucleics i un format de detecció tipus sándwich. Es dissenyen encebadors per a microlagues i virus i s’optimitzen paràmetres de l’etapa d’amplificació. Les partícules magnètiques s’utilitzen com a suport d’immobilització per al desenvolupament dels biosensors electroquímics, així com a eina de captura i preconcentració de virus. Finalment, es demostra l’aplicabilitat de les eines desenvolupades a través de l’anàlisi de mostres mediambientals d’aigua de mar/macroalges contaminades amb microlagues i mostres d’aigua de mar/ostres contaminades amb herpesvirus de la ostra, i la posterior comparació dels resultats amb tècniques ben establertes (microscopia i/o qPCR). La visió que persegueix d’aquest treball és contribuir a obrir camí cap a la implementació d’eines d’anàlisi ràpides, específiques, fàcils d’utilitzar, de baix cost i in situ per millorar la investigació, el seguiment i la gestió dels riscos biològics marins.

El objetivo de esta tesis es contribuir al desarrollo y la aplicabilidad de ensayos y biosensores basados en ADN para la detección de microalgas (i.e Karlodinium and Ostreopsis) y virus (i.e. herpesvirus de la ostra) tóxicos de origen marino, así como contribuir a otras etapas del proceso analítico, como son el pretratamiento de la muestra y la extracción del ADN. Estas nuevas herramientas incluyen ensayos para qPCR, ensayos colorimétricos, biosensores electroquímicos y estrategias de captura basadas en el uso de partículas magnéticas. Se describe un ensayo de qPCR combinado con un método de extracción de ADN rápido y sencillo para la detección de Karlodinium. La variedad de ensayos colorimétricos y biosensores electroquímicos que se presentan para la detección de especies de Karlodinium, Ostreopsis y herpesvirus de la ostra explotan la técnica de amplificación isotérmica mediante la recombinasa y polimerasa (RPA, recombinase polymerase amplification), cebadores modificados con colas de ácidos nucleicos y un formato de detección tipo sándwich. Se diseñan cebadores para microalgas y virus y se optimizan parámetros de la etapa de amplificación. Las partículas magnéticas se utilizan como soporte de inmovilización para el desarrollo de los biosensores electroquímicos, así como herramienta de captura y pre concentración de virus. Finalmente, se demuestra la aplicabilidad de las herramientas desarrolladas mediante el análisis de muestras medioambientales de agua de mar/macroalgas contaminadas con microalgas y muestras de agua de mar/ostras contaminadas con herpesvirus de la ostra, y la posterior comparación los resultados con técnicas bien establecidas (microscopía y/o qPCR). La visión que persigue de este trabajo es contribuir a abrir camino hacia la implementación de herramientas de análisis rápidas, específicas, fáciles de utilizar, de bajo coste e in situ para mejorar la investigación, el seguimiento y el manejo de los riesgos biológicos marinos.

This thesis aims to contribute to the development and applicability of DNA-based assays and biosensors for the detection of toxic marine microalgae (i.e. Karlodinium and Ostreopsis) and viruses (i.e. ostreid herpesvirus-1, OsHV-1), as well as to other steps in the environmental analysis process, such as sample pre-treatment and DNA extraction. These new DNA-based approaches include qPCR assays, colorimetric assays, electrochemical biosensors and MB-based capture strategies. A qPCR assay for the detection of Karlodinium species, combined with a simple and rapid DNA extraction method, is described. The variety of colorimetric assays and electrochemical biosensors developed for the detection of species of Karlodinium, Ostreopsis and/or OsHV-1 exploit the isothermal recombinase polymerase amplification technique, tailed primers and a sandwich hybridisation detection format. Primer design for microalgae and viruses and optimisation of RPA and qPCR parameters are covered. Magnetic beads are exploited as immobilisation supports in the development of electrochemical biosensors, and also as an OsHV-1 capture and pre-concentration strategy. The applicability of the developed DNA-based tools to the analysis of microalgae-contaminated seawater/macroalgae environmental samples and OsHV-1 contaminated seawater/oyster samples is demonstrated by their comparison with well-established techniques (i.e. light microscopy and/or qPCR). The vision underlying this work is to contribute to pave the way towards the implementation of rapid, specific, easy-to-use, low-cost and in situ analysis tools to eventually improve research, monitoring and management of marine biological hazards.