Multiplexed detection of SNPs using electrochemical melting curve analysis

Abstract

L'objectiu general d'aquesta tesi doctoral és desenvolupar plataformes de geno-sensors de baix cost per a la detecció múltiple de polimorfismes d'un sol nucleòtid. La determinació de polimorfismes d'un sol nucleòtid (SNP) és de gran importància en les ciències de la vida, tenint aplicació en la medicina personalitzada, estratificació de pacients, forense, a més de brindar informació sobre la predisposició a la malaltia. En l'actualitat, els mètodes basats en l'electroquímica es revelen com alternatives atractives a les tècniques més utilitzades per determinar el punt de fusió de l'ADN, per la seva alta sensibilitat, simplicitat, rendibilitat i compatibilitat amb la microfabricació. La primera plataforma es va basar en una reacció d'extensió d'encebadors electroquímics, on els polioximetalats actius redox de Keggin i Dawson es van utilitzar per modificar dideoxinucleótids a través de la formació d'enllaços amida. La segona plataforma es basa en la detecció de polimorfismes d'un sol nucleòtid mitjançant l'anàlisi electroquímic de la corba de desnaturalització. L'enfocament es basa en l'anàlisi de la corba de desnaturalització en fase sòlida que utilitza sondes immobilitzades en elèctrodes d'or. Es va desenvolupar un prototip de dispositiu capaç de detectar un ADN diana que porta un SNP relacionat amb la miocardiopatia amb una sola base en la diferència. Finalment, aquest dispositiu es va aplicar a la detecció de SNP en mostres de sang reals. La diana de seqüència de SNP relacionada amb l'osteoporosi es va extreure d'una punxada al dit i es va amplificar usant PCR asimètrica. A més, es van optimitzar les condicions d'amplificació per obtenir el millor rendiment del producte i es va definir l'SNP d'una mostra de sang.

El objetivo general de esta tesis doctoral es desarrollar plataformas de geno-sensores de bajo costo para la detección múltiple de polimorfismos de un solo nucleótido. La determinación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) es de gran importancia en las ciencias de la vida, teniendo aplicación en la medicina personalizada, estratificación de pacientes, forense, además de brindar información sobre la predisposición a la enfermedad. En la actualidad, los métodos basados en la electroquímica se revelan como alternativas atractivas a las técnicas más utilizadas para determinar el punto de fusión del ADN, debido a su alta sensibilidad, simplicidad, rentabilidad y compatibilidad con la microfabricación. La primera plataforma se basó en una reacción de extensión de cebadores electroquímicos, donde los polioximetalatos activos redox de Keggin y Dawson se utilizaron para modificar didesoxinucleótidos a través de la formación de enlaces amida. La segunda plataforma se basa en la detección de polimorfismos de un solo nucleótido mediante el análisis electroquímico de la curva de desnaturalización. El enfoque se basa en el análisis de la curva de desnaturalización en fase sólida que utiliza sondas inmovilizadas en electrodos de oro. Se desarrolló un prototipo de dispositivo capaz de detectar un ADN diana que porta un SNP relacionado con la miocardiopatía con una sola base en la diferencia. Finalmente, este dispositivo se aplicó a la detección de SNP en muestras de sangre reales. La diana de secuencia de SNP relacionada con la osteoporosis se extrajo de un pinchazo en el dedo y se amplificó usando PCR asimétrica. Además, se optimizaron las condiciones de amplificación para obtener el mejor rendimiento del producto y se definió el SNP de una muestra de sangre.

The overall objective of this PhD thesis is to develop low cost geno-sensor platforms for multiplexed detection of single nucleotide polymorphism. The determination of single nucleotide polymorphisms (SNP) is of great importance in life sciences, having application in personalised medicine, patient stratification, forensics, as well as providing information regarding predisposition to disease. Nowadays electrochemistry-based methods are revealed as attractive alternatives to the most commonly used techniques for determining DNA melting point, because of their high sensitivity, simplicity, cost-effective and compatibility with microfabrication. The first platform was based on an electrochemical primer extension reaction, where the redox active Keggin and Dawson polyoxymetalates were used to modify dideoxynucleotides through amide bond formation. The second platform is based on the detection of single nucleotide polymorphisms using electrochemical melting curve analysis. The approach is based on solid phase melting curve analysis that exploits probes immobilised on gold electrodes. We developed a home-made electrochemical melting curve analysis device, able to detect a DNA target that carries a SNP related to cardiomyopathy from others with only one base in difference. Finally, this device was applied to SNPs detection in real blood samples. Osteoporosis related SNP sequence target was extracted from a finger prick and amplified using asymmetric Recombinase Polymerase Amplification. Also, the amplification conditions were optimised for best product yield, and the SNP from a blood sample was defined.