Molecular tools for the rapid and cost-effective detection of small molecules

Abstract

L'objectiu d’aquesta tesis fou la identificació de nou aptàmers amb alta afinitat cap a molècules petites i la seva aplicació en el desenvolupament de biosensors i assajos bioanalítics amb una alta sensibilitat. Les molècules diana per a la selecció dels aptàmers van ser la tetrodotoxina (una toxina marina) i la nandrolona (un esteroide anabòlic). Les molècules petites son molècules biològicament actives i la monitorització dels seus nivells en diferents tipus de mostres es de gran interès dins del camp de la biomedicina, la monitorització mediambiental, el control i seguretat alimentaria i l’anàlisi forense. El primer objectiu de la tesis va ser la selecció dels aptàmers necessaris per al desenvolupament dels assajos bioanalítics i els biosensors. Els aptàmers són molècules amb capacitat de bioreconeixement que es poden utilitzar com alternativa als anticossos. Estan formats per àcids nucleics sintètics (ARN/ADN) que poden unir-se de forma específica a la seva molècula diana i que s’obtenen a través d’un procés iteratiu in vitro anomenat SELEX per les seves sigles en anglès (systemic evolution of ligands exponential enrichment). En aquesta tesis es van dur a terme dos metodologies SELEX diferents en combinació amb la “Next generation sequencing” per a la selecció i la identificació dels aptàmers. Varis “binding assays” es van emprar per caracteritzar la afinitat dels aptàmers seleccionats i els candidats amb més afinitat es van escollir per al desenvolupament d’assajos de detecció de les molècules diana. Un assaig híbrid aptàmer-anticòs va ser desenvolupat per a la detecció de tetrodotoxina en extractes de peix globus contaminats. El mateix principi es va utilitzar per al desenvolupament de dos plataformes analítiques diferents: un assaig utilitzant micropous i un format de test ràpid conegut com “dipstick”. Per a la Nandrolona, un assaig colorimètric “label-free” utilitzant nanopartícules d’or va ser desenvolupat, on el canvi de color de vermell a blau indica la presencia de l’analit a la mostra.

El objetivo de esta tesis fue la identificación de nuevos aptámeros con alta afinidad hacía moléculas pequeñas y su aplicación en el desarrollo de biosensores y ensayos bioanalíticos con una alta sensibilidad. Las moléculas diana para la selección de los aptámeros fueron la tetrodotoxina (una toxina marina) y la nandrolona (un esteroide anabólico). Las moléculas pequeñas son moléculas biológicamente activas y la monitorización de sus niveles en distintos tipos de muestra es de gran interés dentro del campo de la biomedicina, la monitorización medioambiental, en control y seguridad alimentario y el análisis forense. El primer objetivo de la tesis fue la selección de los aptámeros necesarios para el desarrollo de los ensayos bioanalíticos y los biosensores. Los aptámeros son moléculas con capacidad de bioreconocimiento que se pueden usar como alternativa a los anticuerpos. Están formados por ácidos nucleicos sintéticos (ARN/ADN) que pueden unirse de forma específica a su molécula diana y que se obtienen o seleccionan a través de un proceso in vitro iterativo que se conoce por las siglas en inglés SELEX (systematic evolution of ligands by exponencial enrichment). En esta tesis se llevaron a cabo dos metodologías SELEX distintas junto con el next generation secuencing para la selección e identificación de los aptameros. Distintos “ensayos de unión o afinidad” fueron desarrollados para caracterizar la afinidad de los aptámeros seleccionados y los candidatos con más afinidad se escogieron para desarrollar los ensayos de detección de las moléculas objetivo. Un ensayo híbrido aptámero-anticuerpo fué desarrollado para la detección de tetrodotoxina en extractos de pez globo contaminados. El mismo principio se utilizó para el desarrollo de dos plataformas analíticas distintas: un ensayo usando micropocillos y un formato de test rápido conocido como “dipstick”. Para la Nandrolona, un ensayo colorimétrico “label-free” utilizando nanopartículas de oro fue desarrollado, con el cambió de color de rojo a azul indicando la presencia del analito en la muestra.

This thesis was focused on the identification of novel aptamers binding to small molecules and their application to the development of highly sensitive bioanalytical assays and biosensors. The target molecules were the marine toxin Tetrodotoxin and the anabolic steroid Nandrolone. Small molecules are biologically active and monitoring their levels in different types of samples is of high interest in the biomedical field, environmental monitoring, food safety and forensic analysis. The first objective was the selection of aptamers required for the development of the assays and biosensors. Aptamers are biorecognition molecules alternative to antibodies. They are artificial synthetic nucleic acids (RNA/DNA) that bind specifically to their target, and they are selected through an in vitro iterative process called Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX). Two different types of selection methodologies were employed for the identification of aptamers in combination with Next Generation Sequencing. Different binding assays were also developed to enable the characterization of the binding properties of the selected aptamer candidates and the chosen aptamers were finally applied in different assays for target detection. A hybrid antibody-aptamer assay was developed for Tetrodotoxin detection in contaminated puffer fish extracts in a microtiter plate format as well as in the portable lateral flow dipstick format. For Nandrolone, a label-free colorimetric assay was developed using gold nanoparticles (AuNPs) with a red-to-blue color change to indicate the presence of nandrolone.