Barcelona 2021 The unique role of Angiogenin in neuroprotection and neurorepair after cerebral ischemia

Abstract

L’ictus és una de les principals causes de mort i discapacitat a tot el món amb un gran impacte socioeconòmic i costos sanitaris. Dades recents mostren que hi ha més de 13 milions de nous ictus anualment, una de cada quatre persones majors de 25 anys tindrà un ictus, 80 milions de persones viuen amb les conseqüències d’un ictus i més de cinc milions de persones moren d’aquesta malaltia anualment. Malgrat aquestes xifres devastadores, els únics tractaments per a l’ictus agut són les teràpies de reperfusió farmacològica per dissoldre el coàgul/trombe o els procediments mecànics per evacuar-lo (trombectomíes).

Afortunadament, són teràpies que salven vides, però amb estrictes protocols d’inclusió i una finestra terapèutica d’unes hores a causa de l’augment de complicacions hemorràgiques si s’administren tardanament o per la falta d’eficàcia. Però no tots els pacients són candidats a teràpies de reperfusió, inclosos els ictus d’origen hemorràgic. A més, els pacients amb ictus també tenen oportunitats terapèutiques amb els programes multidisciplinaris de neurorehabilitació, que s’han integrat en les guies per al maneig de l’ictus.

Per tant, és fonamental investigar noves teràpies per a l’ictus per ser traslladades a la pràctica clínica ràpidament, amb un impacte terapèutic tant en la neuroprotecció com en la neurorreparación. En aquest context, la present tesi investiga el potencial terapèutic de l’angiogenina (ANG) en un model de ratolí d’isquèmia cerebral en un enfocament terapèutic clínicament rellevant.

ANG és una ribonucleasa que regula la proliferació, supervivència, diferenciació o migració cel·lular mitjançant l’activació de diferents vies de senyalització, amb efectes protectors en altres malalties neurològiques com l’esclerosi lateral amiotròfica i el Parkinson, amb la presència de variants genètiques d’ANG. Diferents grups han reportat accions de l’ANG sobre les cèl·lules endotelials i neurals, així com la seva expressió en el cervell després de la isquèmia i en la circulació, suggerint un vincle entre aquesta ribonucleasa i l’ictus.

En la present tesi s’investiguen les accions terapèutiques de l’ANG en el cervell isquèmic en models pre-clínics d’ictus. Amb aquest propòsit, l’ANG-recombinant-humana bioactiva (hr-ANG) s’ha utilitzat com a teràpia per l’ictus en ratolins mascles C57BL/6 en un model d’oclusió transitòria de l’artèria cerebral mitja induïda per un filament de niló. Primer, es va administrar ANG intraperitoneal de forma aguda als 90 minuts o sub-aguda a les 24h de la oclusió. La lesió cerebral i evolució funcional es van avaluar 2 dies després de l’oclusió, mostrant efectes neuroprotectors davant del tractament amb 5 µg-ANG sense complicacions importants, donant suport a la seguretat de la teràpia proposada.

En el tractament subagut s’identifiquen mecanismes de neuroprotecció de la via de senyalització d’apoptosi ja que la molècula efectora, caspasa-3 activa, es va reduir a l’hemisferi ipsilateral isquèmic a les 24 h de tractament en aquells animals que van rebre 5 µg-ANG, confirmat addicionalment per la inhibició de la expressió induïda per isquèmia d’altres molècules apoptòtiques com caspasa-9 activa i Bax. En segon lloc, la teràpia amb 5ug-ANG es va administrar durant 2 setmanes mitjançant múltiples dosis intraperitoneals després de la isquèmia cerebral, i es va avaluar l’impacte en la remodelació neurovascular per densitat de vasos sanguinis, neuroblasts migratoris i cèl·lules proliferatives en el cervell isquèmic. Com s’esperava, es va observar un augment de neuroblasts migratoris des del nínxol neurogènic subventricular cap al teixit infartat en el grup de tractament amb 5ug-ANG, però no es van observar diferències en la remodelació vascular a les dues setmanes.

En general, la present tesi proposa l’hr-ANG com a tractament per l’ictus, basant-se en les seves accions neuroprotectores i neurorreparadores, proposant una aproximació terapèutica clínicament rellevant que podria combinar-se amb els tractaments trombolítics o els programes de neurorehabilitació post-ictus.

El ictus es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo con un gran impacto socioeconómico y costes sanitarios. Datos recientes muestran que hay más de 13 millones de nuevos ictus anualmente, una de cada cuatro personas mayores de 25 años tendrá un ictus, 80 millones de personas viven con las secuelas de un ictus y más de cinco millones de personas mueren de esta enfermedad anualmente. A pesar de estas cifras devastadoras, los únicos tratamientos para el ictus agudo son las terapias de reperfusión farmacológica para disolver el coágulo/trombo o los procedimientos mecánicos para evacuarlo (trombectomías).

Afortunadamente, son terapias que salvan vidas pero con estrictos protocolos de inclusión y una ventana terapéutica de unas horas debido al aumento de complicaciones hemorrágicas si se administran tardíamente o por la falta de eficacia. Pero no todos los pacientes son candidatos a éstas, incluidos los ictus de origen hemorrágico. Además, los pacientes con ictus también tienen oportunidades terapéuticas con los programas multidisciplinarios de neurorrehabilitación, que se han integrado en las guías para el manejo del ictus.

Es fundamental investigar nuevas terapias para el ictus para ser trasladadas a la práctica clínica rápidamente, con un impacto terapéutico tanto en la neuroprotección como en la neurorreparación. En este contexto, la presente tesis investiga el potencial de la angiogenina (ANG) en un modelo de ratón de isquemia cerebral en un enfoque terapéutico clínicamente relevante.

ANG es una ribonucleasa que regula la proliferación, supervivencia, diferenciación o migración celular mediante la activación de diferentes vías de señalización, con efectos protectores en otras enfermedades neurológicas como la esclerosis lateral amiotrófica y el Parkinson, con presencia de variantes genéticas de ANG. Diferentes grupos han reportado acciones de la ANG sobre las células endoteliales y neurales, así como su expresión en el cerebro después de la isquemia y en la circulación, sugiriendo un vínculo entre esta ribonucleasa y el ictus.

En la presente tesis se investigan las acciones terapéuticas de la ANG en el cerebro isquémico en modelos pre-clínicos de ictus. Con este propósito, ANG recombinante humana bioactiva (hr-ANG) se ha utilizado como terapia para el ictus en ratones machos C57BL/6 en un modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media inducida por un filamento de nylon. Primero, se administró ANG intraperitoneal de forma aguda a los 90 minutos o sub-aguda a las 24h de la oclusión. La lesión cerebral y evolución funcional se evaluaron 2 días tras la oclusión, mostrando efectos neuroprotectores frente al tratamiento con 5 µg-ANG sin complicaciones importantes, apoyando a la seguridad de la terapia propuesta.

En el tratamiento subagudo se identifican mecanismos de neuroprotección de la vía de señalización de apoptosis ya que la molécula efectora, caspasa-3 activa, se redujo en el hemisferio ipsilateral isquémico a las 24 h de tratamiento en aquellos animales que recibieron 5µg-ANG, confirmado por la inhibición de la expresión inducida por isquemia de otras moléculas apoptóticas como caspasa-9 activa y Bax. Segundo, la terapia con 5ug-ANG se administró durante 2 semanas mediante múltiples dosis intraperitoneales tras la isquemia cerebral, y se evaluó el impacto en la remodelación neurovascular por densidad de vasos, neuroblastos migratorios y células proliferativas en el cerebro. Como se esperaba, se observó un aumento de neuroblastos migratorios desde el nicho neurogénico subventricular hacia el tejido infartado en el grupo tratado con 5ug-ANG, pero no se observaron diferencias en remodelación vascular a las dos semanas.

La presente tesis propone el tratamiento con hr-ANG para el ictus, basándose en sus acciones neuroprotectoras y neurorreparadores, proponiendo una aproximación terapéutica clínicamente relevante que podría combinarse con los tratamientos trombolíticos o los programas de neurorrehabilitación post-ictus.

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide with major socioeconomic impact and healthcare costs. In this regard recent data shows that there are over 13 million new strokes annually, one in four people over age 25 will have a stroke in their lifetime, 80 million people are currently living with the consequences of a stroke and more than five million people die from stroke annually. Despite these threatening numbers, nowadays the only available treatments for acute stroke are the pharmacological reperfusion therapies to dissolve the clot/thrombus or the mechanical approaches to evacuate the occluding thrombus (thrombectomies). Fortunately, these are effective and saving-live therapies, but with strict inclusion protocols and a short therapeutic time-window of hours after the symptoms onset due to the increase in hemorrhagic complications if administrated late or the lack of efficacy. However, not all patients are candidates for reperfusion therapies including all hemorrhagic strokes, among others. After this acute phase of the disease stroke patients also have therapeutic opportunities with multidisciplinary neurorehabilitation programs, which have been integrated into the guidelines for stroke management for years.

With this scenario it is essential to investigate novel stroke therapies designed to be potentially translated into the clinical practice as rapid as possible, with a therapeutic impact in both neuroprotection and neurorepair. In this context, the present thesis investigates the therapeutic potential of administering Angiogenin (ANG) in a mouse model of cerebral ischemia in a clinically-relevant therapeutic approach.

ANG is a ribonuclease recognized to regulate cell proliferation, survival, differentiation or migration by activating different signaling pathways, with protective effects in other neurological diseases such as amyotrophic lateral sclerosis and Parkinson and known associations with the presence of ANG variants. The potential protective and proliferative actions of ANG protein on endothelial and neural cells has been reported by different research groups as well as its expression in the brain after ischemia and in blood circulation, suggesting a link between this ribonuclease and stroke disease. The present thesis assumes a new step in ANG research, by investigating its therapeutic actions in the ischemic brain in pre-clinical stroke models. With this purpose, bioactive human recombinant ANG (hr-ANG) has been used as post-stroke therapy in C57Bl/6 male mice in a clinically-relevant transient middle cerebral artery occlusion model induced by a nylon filament. First, ANG was intraperitoneally administered either acutely 90 minutes or sub-acutely at 24h of occlusion, and infarct lesion and stroke outcome evaluated 2 days after occlusion, and showing neuroprotective effects in both therapeutic approaches responding to 5 ug-ANG treatment with no major complications supporting the safety of the proposed therapy.

In the subacute therapeutic protocol we identified neuroprotection mechanisms involving the apoptosis signaling pathway since the effector active caspase-3 was reduced in the ischemic ipsilateral hemisphere at 24h of treatment in those animals presenting reduced infarct size, and further confirmed by the inhibition of upstream ischemia-induced active caspase-9 and Bax in the same ischemic hemisphere. Second, the 5ug-ANG therapy was administered during 2 weeks by multiple intraperitoneal doses after cerebral ischemia, and the impact on neurovascular remodeling was evaluated by quantifying vessel density, migrating neuroblasts and proliferative cells in the ischemic brain. Interestingly, increased migrating neuroblasts from the subventricular neurogenic niche towards the infarcted tissue were observed in the 5ug-ANG treatment group, but we no differences in vascular remodeling were observed at two weeks.

Overall the present thesis supports the potential role of hr-ANG as a treatment for ischemic stroke, based on its previously-reported neuroprotective and neurorepair actions, proposing a therapeutic clinically-relevant time-window which could be further combined with approved thrombolytic treatments or neurorehabilitation programs.