Organització molecular dels aferents sinàptics de tipus C i la seva implicació en la patologia degenerativa de la neurona motora

Abstract

L’esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia que cursa amb degeneració i pèrdua de les motoneurones (MNs), determinant una paràlisi muscular progressiva i de pronòstic fatal. L’acumulació de la proteïna superòxid dismutasa 1 mal plegada (mfSOD1) en les MNs és el factor intrínsec distintiu de la patologia en el model murí per l’estudi de l’ELA SOD1G93A que reprodueix una forma familiar de la ELA humana. No obstant, factors extrínsecs a les MNs tals com l’activitat elèctrica mitjançada per les aferències sinàptiques, així com l’entorn cel•lular determinat per les cèl•lules glials, també són molt rellevants en la fisiopatologia de l’ELA. Entre les aferències, els botons C (BC) són uns importants reguladors colinèrgics de l’excitabilitat de les MNs. Aquests es caracteritzen per tenir una cisterna subsinàptica (SSC) adjacent a la membrana postsinàptica, on s’hi ha descrit un complex macromolecular específic format per diferents proteïnes, entre elles, la neuregulina-1 (NRG1). Tot i que s’han descrit alteracions en els BC en l’ELA, la funció de la NRG1 en la fisiologia i la patologia de la MN es completament desconeguda. L’objectiu del present treball ha estat caracteritzar millor l’arquitectura molecular del BC i analitzar les seves alteracions així com la implicació en la regulació de la resposta microglial al voltant de les MNs danyades. Per a aquesta finalitat, hem analitzat la localització i distribució de diverses proteïnes dins dels subcompartiments sinàptics del BC i la seva relació amb la glia mitjançant microscòpia confocal i electrònica en diferents models animals. Els resultats demostren que, en la SSC, la NRG1 està situada en microdominis molt específics i no solapats amb altres proteïnes, mentre que el seu receptor, els ErbB2/4, estan presents en el compartiment presinàptic adjacent. D’altra banda, també s’ha evidenciat que les diferents isoformes de NRG1 regulen funcions diferents en el BC específicament a nivell pre- o postsinàptic. Les aferències de tipus C es desorganitzen en presència d’estressos aguts, tals com la lesió del nervi perifèric, on aquesta pèrdua de BCs es produeix en conjunció a un augment del reclutament de cèl•lules microglials. A més, la micròglia, està involucrada en l’eliminació del detritus de terminals sinàptics prèviament desintegrats per la via necroptòtica activada després de l’axotomia. En el model murí SOD1G93A, hem definit 3 fenotips de MNs d’acord a l’expressió de mfSOD1 i a la degeneració vacuolar. Hem caracteritzat aquesta vacuolització utilitzant marcadors mitocondrials i de vesícules extracel•lulars així com la seva relació amb els canvis en les aferències sinàptiques i l’activació microglial. En conjunt, els nostres resultats aporten noves dades sobre l’organització dels BC i dels canvis que tenen lloc tant en lesions agudes en les MNs com en l’ELA. També aportem noves dades sobre la citopatologia relacionada amb l’expressió de mfSOD1 durant les fases inicials de la degeneració de les MNs en l’ELA.

La esclerosis lateral amiotròfica (ELA) es una enfermedad que cursa con degeneración y pérdida de las motoneurones (MNs), determinando una parálisis muscular progresiva y de pronóstico fatal. La acumulación de la proteína superóxido dismutasa 1 mal plegada (mfSOD1) en las MNs es el factor intrínseco distintivo de la patología en el modelo murino para el estudio de la ELA SOD1G93A, el cual reproduce una forma familiar de la ELA humana. No obstante, factores extrínsecos a las MNs como la actividad eléctrica mediada por las aferencias sinápticas, así como el entorno celular determinado por las células gliales, también son muy relevantes en la fisiopatología de la ELA. Entre las aferencias, los botones C (BC) son unos importantes reguladores colinérgicos de la excitabilidad de las MNs. Estos se caracterizan por tener una cisterna subsináptica (SSC) adyacente a la membrana postsináptica, dónde se ha descrito un complejo macromolecular específico formado por distintas proteínas, entre ellas, la neuregulina-1 (NRG1). Aunque se han descrito alteraciones en los BC en la ELA, la función de la NRG1 en la fisiología y la patología de la MN es completamente desconocida. El objetivo del presente trabajo ha sido caracterizar mejor la arquitectura molecular del BC y analizar sus alteraciones, así como su implicación en la regulación de la respuesta microglial alrededor de las MNs dañadas. Para esta finalidad, hemos analizado la localización y distribución de varias proteínas de los subcompartimentos sinápticos de los BC y su relación con la glía mediante microscopía confocal y electrónica en distintos modelos animales. Los resultados demuestran que, en la SSC, la NRG1 está ubicada en microdominios muy específicos y no solapados con otras proteínas, mientras que su receptor, los ErbB2/4, están presentes en el compartimento presináptico adyacente. Por otro lado, también se ha evidenciado que las distintas isoformas de NRG1 regulan funciones diferentes en los BC específicamente a nivel pre- o postsináptico. Las aferencias de tipo C se desorganizan en presencia de un estrés agudo como es la lesión del nervio periférico, dónde ésta pérdida de BCs se produce junto a un aumento del reclutamiento de células microgliales. Además, la microglía, está involucrada en la eliminación de los detritus de los terminales sinápticos previamente desintegrados por la vía necroptótica activada después de la axotomía. En el modelo murino SOD1G93A, hemos definido 3 fenotipos de MNs de acuerdo a la expresión de mfSOD1 y a la degeneración vacuolar. Hemos caracterizado la vacuolización mediante marcadores mitocondriales y de vesículas extracelulares, así como su relación con los cambios con las aferencias sinápticas y la activación microglial. En conjunto, nuestros resultados aportan nuevos datos sobre la organización de los BC y de los cambios que tienen lugar tan en lesiones agudas en las MNs como en la ELA. También aportamos nuevos datos sobre la citopatologia relacionada con la expresión de mfSOD1 durante las fases iniciales de la degeneración de las MNs en la ELA.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal disease characterised by the degeneration and loss of motor neurons (MNs) determining a progressive muscle paralysis. A distinctive intrinsic factor in the ALS mice model SOD1G93A is the accumulation of superoxide dismutase protein in a misfolded form (mfSOD1), reproducing a familiar form of human ALS. However, extrinsic factors such as electric activity mediated by synaptic afferents, along with glial cellular environment, are crucial in ALS physiopathology. Among the afferents, C-boutons (BC) are very important cholinergic regulators of MN excitability. A distinctive feature of BC is the presence of an endoplasmic reticulum-related subsynaptic cistern (SSC) close to the postsynaptic membrane. At this site, a specific macromolecular complex formed by a variety of proteins, including neuregulin-1 (NRG1), has been described. Although some alterations in BC have been described in ALS, the role of NRG1 in BC signalling in normal or altered MNs is not known. The main objective of the present work is to characterise the molecular architecture of BC and to investigate how is altered in injured MNs; also the BC-derived signalling in the regulation of the neuroinflammatory response that takes place at the vicinity of damaged MNs was analysed. To this aim, we applied confocal and electron microscopy in different animal models, and the we have determined the localisation of a variety of proteins in relation to the distinct BC synaptic subcompartments and its relation with glial cells. Our results showed that NRG1 is specifically concentrated at the SSC forming non-overlapping microdomains with other SSC proteins. By contrast, its receptors ErbB2/4 are identified in the adjacent presynaptic compartment. Furthermore, we have also found that different NRG1 isoforms are involved in the regulation of BC morphogenesis acting differentially on its pre- or postsynaptic components. BCs is disorganised in response to acute stressors, such as a peripheral nerve injury. In this situation, the loss of BCs is produced in conjunction of local recruitment of microglial cells. We also described how microglia is involved in the elimination of degenerating synaptic terminal, which were previously disrupted by a mechanism involving necroptotic pathway that was activated after axotomy. In SOD1G93A mice model, we have defined 3 MN phenotypes according to the expression of mfSOD1 and vacuolar degeneration at the early presymptomatic stages of the disease. Vacuolar degeneration was characterised using mitochondrial and extracellular vesicle markers and its relationship with changes in afferent synapses and microglial cell activation. As a whole, our results provide new data on molecular organisation of the BC and the changes that takes place both, in acutely injured MNs and also during ALS. Furthermore, we provide new data regarding the cytopathology of mfSOD1 expression during early phases of MN degeneration in ALS.