D-[113–122]apoJ mimetic peptide as a therapy against atherosclerosis. In vitro and in vivo approaches

Abstract

Els pèptids mimètics són potencials agents terapèutics per a la prevenció de l’aterosclerosi. D- [113-122] apoJ és un pèptid de classe G * de 10 residus de l’apolipoproteïna J (apoJ); posseeix propietats antiinflamatòries i anti-aterogèniques. Això ens ha portat a estudiar el seu efecte sobre el procés d’agregació in vitro i in vivo de partícules de les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL), el qual és un esdeveniment d’hora en l’evolució de l’aterosclerosi. També analitzem l’efecte d’aquest pèptid en ratolins knockout de el receptor de lipoproteïnes de baixa densitat (LDLR-KO) sobre el desenvolupament de l’aterosclerosi i la funció de les lipoproteïnes. Per als estudis in vitro, les partícules de LDL en presència o absència de l’pèptid D- [113-122] apoJ es van incubar a 37 ° C amb esfingomielinasa (SMASA) o es van deixar afegir espontàniament a temperatura ambient. El procés d’agregació es va analitzar mitjançant cromatografia d’exclusió per mida (SEC), electroforesi en gel de gradient natiu (GGE), absorbància a 405 nm, dispersió dinàmica de llum (DLS) i microscòpia electrònica de transmissió (TEM). A més, es va emprar dicroisme circular per determinar canvis en l’estructura secundària de apoB. El pèptid D- [113-122] apoJ va inhibir l’agregació de LDL tant induïda per SMASA com espontània en una proporció equimolar de pèptid D- [113-122] apoJ a apoB-100. Tots els mètodes van mostrar que aquest pèptid retardava la progressió de l’agregació de LDL induïda per SMASA en temps d’incubació prolongats i no es va observar cap efecte de D- [113-122] apoJ sobre l’estructura secundària de apoB. Els experiments d’unió van mostrar que aquest pèptid presenta baixa afinitat per la LDL nativa, però s’uneix fàcilment a la LDL durant les primeres etapes d’agregació. Per als estudis in vivo, ratolins LDLR-KO alimentats amb una dieta aterogènica de tipus occidental es van tractar per via subctánea (tres dies a la setmana) durant vuit setmanes amb pèptid D- [113-122] apoJ, un pèptid scramble o un vehicle . A l’acabar el tratamento i després de l’eutanàsia, es va extreure sang i es va estudiar l’arc aòrtic a la recerca de lesions ateroscleròtiques. Es van aïllar les lipoproteïnes i es va analitzar la seva composició i funcionalitat. Es va observar que l’àrea de les lesions ateroscleròtiques va ser un 43% menor amb el tractament amb D- [113-122] apoJ que amb el vehicle o scramble. El perfil lipídic va ser similar entre els grups, però la lipoproteïna d’alta densitat (HDL) dels ratolins tractats amb D-[113-122] apoJ tenia una major capacitat antioxidant i una major capacitat per promoure el eflux de colesterol que el grup control . A més, la lipoproteïna de baixa densitat (LDL) de ratolins tractats amb D-[113-122] apoJ va ser més resistent a l’agregació induïda i presentar menor electronegativitat que en els ratolins tractats amb D-[113-122] apoJ. Aquests resultats demostren que el pèptid D- [113-122] apoJ no només prevé l’agregació de LDL induïda per SMASA in vitro i in vivo, sinó que també prevé l’extensió de les lesions ateroscleròtiques en models de ratolins, el que podria explicar-se parcialment per la millora de la funcionalitat de les lipoproteïnes. Els nostres resultats obren la possibilitat de l’ús d’aquest pèptid mimètic com a eina terapèutica davant l’arteriosclerosi.

Los péptidos miméticos son potenciales agentes terapéuticos para la prevención de la aterosclerosis. D- [113-122] apoJ es un péptido de clase G* de 10 residuos de la apolipoproteína J (apoJ); posee propiedades antiinflamatorias y anti-aterogénicas. Esto nos ha llevado a estudiar su efecto sobre el proceso de agregación in vitro e in vivo de partículas de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), el cual es un evento temprano en la evolución de la aterosclerosis. También analizamos el efecto de este péptido en ratones knockout del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR-KO) sobre el desarrollo de la aterosclerosis y la función de las lipoproteínas. Para los estudios in vitro, las partículas de LDL en presencia o ausencia del péptido D- [113-122] apoJ se incubaron a 37 ° C con esfingomielinasa (SMasa) o se dejaron agregar espontáneamente a temperatura ambiente. El proceso de agregación se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), electroforesis en gel de gradiente nativo (GGE), absorbancia a 405 nm, dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Además, se empleó dicroísmo circular para determinar cambios en la estructura secundaria de apoB. El péptido D- [113-122] apoJ inhibió la agregación de LDL tanto inducida por SMasa como espontánea en una proporción equimolar de péptido D- [113-122] apoJ a apoB-100. Todos los métodos mostraron que este péptido retardaba la progresión de la agregación de LDL inducida por SMasa en tiempos de incubación prolongados y no se observó ningún efecto de D- [113-122] apoJ sobre la estructura secundaria de apoB. Los experimentos de unión mostraron que este péptido presenta baja afinidad por la LDL nativa, pero se une fácilmente a la LDL durante las primeras etapas de agregación. Para los estudios in vivo, ratones LDLR-KO alimentados con una dieta aterogénica de tipo occidental se trataron por vía subctánea (tres días a la semana) durante ocho semanas con péptido D- [113-122] apoJ, un péptido scramble o un vehículo. Al finalizar el tratamento y después de la eutanasia, se extrajo sangre y se estudió el arco aórtico en busca de lesiones ateroscleróticas. Se aislaron las lipoproteínas y se analizó su composición y funcionalidad. Se observó que el área de las lesiones ateroscleróticas fue un 43% menor con el tratamiento con D- [113-122] apoJ que con el vehículo o scramble. El perfil lipídico fue similar entre los grupos, pero la lipoproteína de alta densidad (HDL) de los ratones tratados con D- [113-122] apoJ tenía una mayor capacidad antioxidante y una mayor capacidad para promover el eflujo de colesterol que el grupo control. Además, la lipoproteína de baja densidad (LDL) de ratones tratados con D- [113-122] apoJ fue más resistente a la agregación inducida y presentó menor electronegatividad que en los ratones tratados con D- [113-122] apoJ. Estos resultados demuestran que el péptido D- [113-122] apoJ no solo previene la agregación de LDL inducida por SMasa in vitro e in vivo, sino que también previene la extensión de las lesiones ateroscleróticas en modelos de ratones, lo que podría explicarse parcialmente por la mejora de la funcionalidad de las lipoproteínas. Nuestros resultados abren la posibilidad del uso de este péptido mimético como herramienta terapéutica frente la arteriosclerosis.

Mimetic peptides are potential therapeutic agents for atherosclerosis prevention. D-[113–122]apolipoprotein (apo) J (D-[113–122]apoJ) is a 10-residue class G* peptide from apolipoprotein J(apoJ); it possesses anti-inflammatory and anti-atherogenic properties. This prompted us to study its effect on the in vitro and in vivo aggregation process of low-density lipoprotein (LDL) particles, an early event in the evolution of atherosclerosis. We also analyzed the effect of this peptide in low-density lipoprotein receptor knockout mice (LDLR-KO) on the development of atherosclerosis and lipoprotein function. For in vitro studies, LDL particles in presence or absence of D-[113–122]apoJ peptide were incubated at 37 °C with sphingomyelinase (SMase) or were left to aggregate spontaneously at room temperature. The aggregation process was analyzed by size-exclusion chromatography (SEC), native gradient gel electrophoresis (GGE), absorbance at 405 nm, dynamic light scattering (DLS), and transmission electronic microscopy (TEM). Additionally, circular dichroism was employed to determine changes in the secondary structure of apoB. At an equimolar ratio of D-[113–122]apoJ peptide to apoB-100, D-[113–122]apoJ inhibited both SMase-induced or spontaneous LDL aggregation. All methods showed that this peptide retarded the progression of SMase-induced LDL aggregation at long incubation times. No effect of D-[113–122]apoJ on apoB secondary structure was observed. Binding experiments showed that this peptide presents low affinity for native LDL but it binds readily to LDL during the first stages of aggregation. For in vivo studies, female LDLR-KO mice fed an atherogenic Western-type diet were treated for eight weeks with D-[113–122]apoJ peptide, a scrambled peptide, or vehicle. Peptides were dispensed subcutaneously three days per week. After euthanasia, blood was collected and the aortic arch was studied for the presence of atherosclerotic lesions. Lipoproteins were isolated and their composition and functionality were analyzed. The area of atherosclerotic lesions was 43% lower with D-[113–122]apoJ treatment than with the vehicle or scramble. The lipid profile was similar between groups, but the high-density lipoprotein (HDL) of D-[113–122]apoJ-treated mice had a higher antioxidant capacity and increased ability to promote cholesterol efflux than the control group. Moreover, low-density lipoprotein (LDL) from D-[113–122]apoJ-treated mice was more resistant to induced aggregation and presented lower electronegativity than in mice treated with D-[113–122]apoJ. These results demonstrate that D-[113–122]apoJ peptide not only prevents in vitro and in vivo SMase-induced LDL aggregation but also prevents the extent of atherosclerotic lesions in mice models, which could be partially explained by the improvement of lipoprotein functionality. Our results open the possibility for the use of this mimetic peptide as a therapeutic tool.