Characterization of alterations in sensory neuronal populations in amyotrophic lateral sclerosis

Abstract

Tot i que l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia eminentment motora, en els últims anys s’ha descrit l’existència de manifestacions no motores, incloent l’afectació sensitiva. L’objectiu d’aquesta tesi és la caracterització de l’afectació sensitiva en aquesta malaltia. Per complir amb aquest objectiu, en primer lloc, considerem si el model animal més utilitzat (el ratolí SOD1G93A) presenta també algunes de les alteracions sensitives ja conegudes en humans amb ELA. Posteriorment, vam estudiar diferents poblacions sensitives des de la part més perifèrica (pell) fins al cos neuronal (gangli raquidi dorsal; DRG) per tenir un mapa de l’evolució temporoespacial d’aquesta afectació. A continuació, vam investigar si els pacients amb ELA, a més de la pèrdua de axons sensitius cutanis, presentaven altres alteracions típiques de la malaltia com la translocació citoplasmàtica de TDP-43. En un primer estudi trobem en el model murí una pèrdua d’axons intraepidèrmics ja en una fase presimptomàtica. A més, no només hi ha una pèrdua de fibres petites no mielinitzades / pobrament mielinitzades, sinó també de fibres gruixudes, com el cas dels corpuscles de Meissner. També trobem un gradient d’afectació des de la part més superficial a la més profunda, amb major pèrdua en epidermis que fa a la dermis, suggerint l’existència d’una axonopatia sensitiva distal. A continuació, es va realitzar una caracterització de diferents poblacions sensitives afectades, no només a través del seguiment en diferents estadis evolutius sinó també de la seva progressió des del axó fins al cos neuronal. A nivell perifèric (cutani) es van estudiar les poblacions peptidèrgiques (CGRP) i no-peptidèrgiques (IB4), així com la innervació simpàtica colinèrgica de les glàndules sudorípares (VIP). A nivell del DRG distingim 3 grups de neurones: CGRP, IB4 i parvalbúmina (PV), aquesta última corresponent a mecanoreceptors i especialment a propioceptors. En l’anàlisi cutani observem una pèrdua d’axons intraepidèrmics d’ambdues poblacions sensitives en els ratolins SOD1, ja en fase presimptomàtica, amb una afectació més primerenca de les fibres no-peptidèrgiques. També es va detectar una pèrdua d’innervació sudomotora. A l’analitzar el grup de neurones de l’DRG, no es va trobar pèrdua dels seus cossos neuronals en cap població neuronal estudiada. L’afectació de la porció distal dels axons juntament amb la preservació del cos neuronal ens porta a considerar que l’afectació sensitiva subjacent segueix un patró de axonopatia sensitiva distal. Finalment, es van estudiar mostres de pell de pacients amb ELA per determinar si hi havia acumulació de TDP-43 en els axons sensitius. Vam obtenir mostres de biòpsies cutànies de pacients amb ELA i les vam comparar amb un grup de controls sans i controls neurològics. No trobem colocalització del senyal de TDP-43 en els axons cutanis de cap dels grups. No obstant això, sí observem el dipòsit citoplasmàtic de TDP-43 en els queratinòcits de l’epidermis, i en els fibroblasts de la dermis. Aquesta translocació citoplasmàtica en fibroblasts va ser més gran i més freqüent en ELA. En conclusió, en el model murí d’ELA (SOD1G93A) hi ha una afectació distal predominant de les fibres sensitives intraepidèrmiques, de forma global, encara que amb major i més d’hora predomini de les fibres no-peptidèrgiques. Aquesta afectació progressa en el temps, precedeix a la simptomatologia motora, i no s’acompanya de degeneració de el cos neuronal, el que suggereix un model de axonopatia sensitiva distal, similar al que reportat a nivell motor, on s’ha descrit una denervació del múscul esquelètic amb pèrdua de sinapsis molt abans de l’aparició dels símptomes i la pèrdua de motoneurones de la banya anterior medul·lar. A més, en humans amb ELA no trobem una acumulació de TDP-43 en els axons sensitius cutanis, però sí en el citoplasma dels fibroblasts.

Aunque la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad eminentemente motora, en los últimos años se ha descrito la existencia de manifestaciones no motoras, incluyendo la afectación sensitiva. El objetivo de esta tesis es la caracterización de la afectación sensitiva en esta enfermedad. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, consideramos si el modelo animal más utilizado (el ratón SOD1G93A) presenta también algunas de las alteraciones sensitivas ya conocidas en humanos con ELA. Posteriormente, estudiamos diferentes poblaciones sensitivas desde la parte más periférica (piel) hasta el cuerpo neuronal (ganglio raquídeo dorsal; DRG) para tener un mapa de la evolución temporo-espacial de esta afectación. A continuación, investigamos si los pacientes con ELA, además de la pérdida de axones sensitivos cutáneos, presentaban otras alteraciones típicas de la enfermedad como la translocación citoplasmática de TDP-43. En un primer estudio encontramos en el modelo murino una pérdida de axones intraepidérmicos ya en una fase presintomática. Además, no sólo hay una pérdida de fibras pequeñas no mielinizadas/pobremente mielinizadas, sino también de fibras gruesas, como el caso de los corpúsculos de Meissner. También encontramos un gradiente de afectación desde la parte más superficial a la más profunda, con mayor pérdida en epidermis respecto a la dermis, sugiriendo la existencia de una axonopatía sensitiva distal. A continuación, se realizó una caracterización de diferentes poblaciones sensitivas afectadas, no sólo a través del seguimiento en diferentes estadios evolutivos sino también de su progresión desde el axón hasta el cuerpo neuronal. A nivel periférico (cutáneo) se estudiaron las poblaciones peptidérgicas (CGRP) y no-peptidérgicas (IB4), así como la inervación simpática colinérgica de las glándulas sudoríparas (VIP). A nivel del DRG distinguimos 3 grupos de neuronas: CGRP, IB4 y parvalbúmina (PV), esta última correspondiente a mecanorreceptores y especialmente a propioceptores. En el análisis cutáneo observamos una pérdida de axones intraepidérmicos de ambas poblaciones sensitivas en los ratones SOD1, ya en fase presintomática, con una afectación más temprana de las fibras no-peptidérgicas. También se detectó una pérdida de inervación sudomotora. Al analizar el grupo de neuronas del DRG, no se encontró pérdida de sus somas en ninguna población neuronal estudiada. La afectación de la porción distal de los axones junto con la preservación del cuerpo neuronal nos lleva a considerar que la afectación sensitiva subyacente sigue un patrón de axonopatía sensitiva distal. Por último, se estudiaron muestras de piel de pacientes con ELA para determinar si había acumulación de TDP-43 en los axones sensitivos. Obtuvimos muestras de biopsias cutáneas de pacientes con ELA y las comparamos con un grupo de controles sanos y controles neurológicos. No encontramos colocalización de la señal de TDP-43 en los axones cutáneos de ninguno de los grupos. Sin embargo, sí observamos el depósito citoplasmático de TDP-43 en los queratinocitos de la epidermis, y en los fibroblastos de la dermis. Esta translocación citoplasmática en fibroblastos fue mayor y más frecuente en ELA. En conclusión, en el modelo murino de ELA (SOD1G93A) existe una afectación distal predominante de las fibras sensitivas intraepidérmicas, de forma global, aunque con mayor y más temprano predominio de las fibras no-peptidérgicas. Dicha afectación progresa en el tiempo, precede a la sintomatología motora, y no se acompaña de degeneración del cuerpo neuronal, lo que sugiere un modelo de axonopatía sensitiva distal, similar a lo reportado a nivel motor, donde se ha descrito una denervación del músculo esquelético con pérdida de sinapsis mucho antes de la aparición de los síntomas y la pérdida de motoneuronas de la asta anterior medular. Además, en humanos con ELA no encontramos una acumulación de TDP-43 en los axones sensitivos cutáneos, pero sí en el citoplasma de los fibroblastos.

Although amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is eminently a motor disease, the existence of non-motor manifestations, including sensory involvement, has been described in the last years. The aim of this thesis is the characterization of sensory involvement in this disease. To meet this objective, we first considered whether the most used animal model of the disease (SOD1G93A mouse) also presents some of the sensory alterations already known in humans with ALS. Subsequently, we studied different sensory populations from the most peripheral part (skin) to the body of neurons (dorsal root ganglion; DRG) to have a map of the temporal and spatial evolution of this involvement. Next, we investigated whether ALS patients, in addition to the loss of cutaneous sensory axons, also presented other pathological alterations typical of the disease such as TDP-43 cytoplasmic translocation. In a first study we found in the murine model a loss of intraepidermal axons already at a presymptomatic stage. Furthermore, there is not only a loss of unmyelinated/thin myelinated fibers but also of large fibers such in the case of Meissner corpuscles. We also found a gradient of involvement from the most superficial to the deepest part, with greater loss in the epidermis with respect to the dermis, suggesting the existence of a distal sensory axonopathy. Then, a characterization of the different affected sensory populations was performed, not only through the follow-up in the different evolutionary stages but also their progression from the axon to the body of the neurons. At the peripheral (cutaneous) level, peptidergic (CGRP) and non-peptidergic (IB4) populations were studied, as well as the cholinergic sympathetic innervation of sweat glands (VIP). At the level of the DRG we distinguished 3 groups of neurons: CGRP, IB4, and parvalbumin (PV), the latter corresponding to mechanoreceptors and especially proprioceptors. In the cutaneous analysis we observed a loss of intraepidermal axons of both sensory populations in the SOD1 mice, already at the presymptomatic motor stage, with an earlier involvement of non-peptidergic fibers. Also, a loss of sudomotor innervation was also detected. When analyzing the group of neurons in the DRG, no loss of their somas was found in any neural population studied. The involvement of the distal portion of the axons together with the preservation of the body of the neurons leads us to consider that the underlying sensory involvement follows a pattern of distal sensory axonopathy. Finally, skin samples from ALS patients were studied to determine whether there was accumulation of TDP-43 in the sensory axons. We obtained skin biopsy samples from ALS patients and compared them with a group of healthy controls and neurological controls. We did not find colocalization of TDP-43 signal in the cutaneous axons of either group. However, we did observe cytoplasmic deposition of TDP-43 in the keratinocytes of the epidermis, and in fibroblasts of the dermis. Such cytoplasmic translocation in fibroblasts was greater and more frequent in ALS. In conclusion, in the murine model of ALS (SOD1G93A) there is a distal predominant involvement of intraepidermal sensory fibers, globally, although with a greater and earlier predominance of non-peptidergic fibers. Such involvement progresses over time, precedes motor symptomatology, and is not accompanied by neuronal body degeneration, suggesting a model of distal sensory axonopathy, similar to what has been reported at the motor level, where has been described a denervation of skeletal muscle with a loss of synapses long before the onset of symptoms and the loss of anterior horn motor neurons in the spinal cord. Furthermore, in human with ALS we did not find an accumulation of TDP-43 in cutaneous sensory axons but found it significantly in the cytoplasm of fibroblasts.