Methodological Challenges in Ancient and Forensic DNA Analysis: Improvements in DNA Extraction and Genetic Characterization from Human Skeletal Remains

Abstract

En els últims 40 anys, els camps de l’ADN antic i forense han experimentat un desenvolupament impressionant dels seus mètodes i procediments. Aquests avenços han estat des de una simple Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) fins a la Secuenciación Masiva o de Nueva Generación (NGS), reduint els costos i el temps invertit, incrementant la informació genètica obtinguda. L’objectiu és diferent entre les dues disciplines, ADNa i ADN Forense. La genètica forense es centra en la identificació amb fines legals, mentre que l’ADNa té objectius més amplis, com la reconstrucció de la població. De esta forma, los estudios genéticos a partir de restos óseos podrían ser útiles para interpretar nuestro pasado evolutivo a través de la paleogenética o identificar a una persona a través de la genética forense. A pesar dels avances tècnics, la recuperació de l’ADN degradat sigue siendo una tarea difícil a causa de la seva escasez i dany molecular. Per tant, la primera missió a abordar ha de centrar-se en aquest problema: millorar la seva recuperació. La present tesi doctoral contribueix a aquesta àrea de diferents formes metodològiques: 1) comparant la contribució d’ADN de diferents tipus d’elements esquelètics (explorats en el capítol 1), 2) buscant un protocol que maximitzi la recuperació del major nombre de molècules a través de estrategias de genotipado de marcadores STR autosómicos y tipificación de la región de control de mtDNA mediante técnicas convencionales (explorado en el capítulo 1), 3) exploración de la recuperación del genoma humano completo a partir de huesos de recién nacidos comparando la eficiencia de recuperación por categories d’edat i tipus d’esqueleto basat en shot-gun NGS (explorat en el capítol 2), 4) provant l’eficiència d’un nou kit NGS per amplificar la regió de control del mtDNA, típicament utilitzat en investigacions forenses i paleogenéticas (explorat). en el capítol 3), 5) i proporcionant una eina bioinformàtica útil per a analitzar les dades de NGS, mostrant el dany mole cular com una senyal de la recuperació autèntica del veritable ADN endógeno (explorat en el capítol 3). En general, aquesta tesis abarcó comparacions de diferents aspectes que poden afectar la recuperació de la informació genètica i que s’han de tenir en compte si aquest tipus de mostres crítiques s’utilitzen amb fines d’identificació o caracterització de poblacions.

En los últimos 40 años, los campos del ADN antiguo y forense han experimentado un impresionante desarrollo de sus métodos y procedimientos. Estos avances han sido desde una simple Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) hasta la Secuenciación Masiva o de Nueva Generación (NGS), reduciendo los costes y tiempo invertido, he incrementando la información genética obtenida. El objetivo es diferente entre las dos disciplinas, ADNa y ADN Forense. La genética forense se centra en la identificación con fines legales, mientras que el ADNa tiene objetivos más amplios, como la reconstrucción de la población. De esta forma, los estudios genéticos a partir de restos óseos podrían ser útiles para interpretar nuestro pasado evolutivo a través de la paleogenética o identificar a una persona a través de la genética forense. A pesar de los avances técnicos, la recuperación del ADN degradado sigue siendo una tarea difícil debido a su escasez y daño molecular. Por tanto, la primera misión a abordar debe centrarse en este problema: mejorar su recuperación. La presente tesis doctoral contribuye a esta tarea de diferentes formas metodológicas: 1) comparando la contribución de ADN de diferentes tipos de elementos esqueléticos (explorados en el capítulo 1), 2) buscando un protocolo que maximice la recuperación del mayor número de moléculas a través de estrategias de genotipado de marcadores STR autosómicos y tipificación de la región de control de mtDNA mediante técnicas convencionales (explorado en el capítulo 1), 3) exploración de la recuperación del genoma humano completo a partir de huesos de recién nacidos comparando la eficiencia de recuperación por categorías de edad y tipo de esqueleto basado en shot-gun NGS (explorado en el capítulo 2), 4) probando la eficiencia de un nuevo kit NGS para amplificar la región de control del mtDNA, típicamente utilizado en investigaciones forenses y paleogenéticas (explorado en el capítulo 3), 5) y proporcionando una herramienta bioinformática útil para analizar los datos de NGS, mostrando el daño molecular como una señal de la recuperación auténtica del verdadero ADN endógeno (explorado en el capítulo 3). En general, esta tesis abarcó comparaciones de diferentes aspectos que pueden afectar la recuperación de información genética y que se deben tenerse en cuenta si este tipo de muestras críticas se utilizan con fines de identificación o caracterización de poblaciones.

In the last 40 years, ancient and forensic DNA fields have developed extraordinarily. The gain was fast and large from simple PCR to NGS, cost and time invested, and information obtained. The goal is different between the two disciplines, aDNA and Forensics, but the methodologies are similar. Forensic genetics focuses on identification for legal purposes, while aDNA has broader goals, such as population reconstruction. In this way, genetic studies from skeletal remains could be useful for interpreting our evolutionary past through paleogenetics or identifying a person through forensic genetics. Despite the technical advances, the recovery of degraded DNA is still a difficult task due to its scarcity and molecular damage. Therefore, the first mission to address must focus on this problem: ameliorate its recovery. The present doctoral thesis contributes to this task in different methodological ways: 1) comparing DNA contribution of different types of skeletal elements (explored in chapter 1), 2) searching for a good and easy protocol that maximizes the recovery of the major number of molecules through strategies of the genotyping of autosomal STR markers and the typing of mtDNA control region by conventional techniques (explored in chapter 1), 3) exploring the recovery of human whole-genome from newborn bones comparing the recovery efficiency by age categories and type of skeletal remains based on shot-gun NGS (explored in chapter 2), 4) probing the efficiency of a new NGS-kit to amplify the control region of mtDNA, typically used in forensic and paleogenetic researches (explored in chapter 3), 5) and providing a useful bioinformatic tool to analyze the NGS data, showing molecular damage as a signal of the authentic recovery of the true endogenous DNA (explored in chapter 3). Overall, this thesis spanned comparisons of different aspects that can affect the retrieval of genetic information, and that should be considered if these types of critical samples are used for identification purposes or population characterization.