The use of bacteriophages for the detection of bacteria in environmental water samples

Abstract

Segons l’OMS (Organització Mundial de la Salut), la contaminació fecal d’aigua potable afecta més de 2.000 milions de persones a tot el món i provoca més de 500.000 morts cada any. L’estratègia actual per al control de la qualitat microbiològica de l’aigua depenen en gran mesura de l’ús de mètodes de cultiu ben validats que proporcionen bons resultats, però que requereixen temps llargs d’incubació. La tendència en aquest camp ha estat la introducció progressiva de mètodes alternatius ràpids que proporcionen resultats en una fracció del temps i permeten una gestió més àgil dels riscs associats a l’aigua de consum. Aquests mètodes inclouen aproximacions basades en la utilització d’àcids nucleics (PCR, qPCR), reaccions basades en anticossos o aptàmers (ELISA) o assajos enzimàtics específics (ATPasa, ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa). Tot i que aquests mètodes ofereixen un resultat força bo, sovint pateixen d’una sèrie d’inconvenients. En la majoria dels casos, els mètodes requereixen reactius cars, l’ús d’equips sofisticats o la participació de personal altament qualificat. Per tant, la cerca d’un mètode senzill, ràpid i específic per a la detecció d’E. coli en mostres d’aigua continua oberta. Aquesta tesi intenta contribuir a aquesta cerca desenvolupant un mètode basat en enzims que utilitza un assaig inespecífic per β-galactosidasa optimitzat per proporcionar una detecció específica d’E. coli mitjançant l’ús d’un bacteriòfag T4. L’optimització de l’assaig de ß-galactosidasa per aconseguir la màxima sensibilitat ha requerit la determinació de valors òptims per als principals paràmetres que afecten el seu rendiment. Els resultats proporcionen una estima aproximada de com la desviació dels valors òptims redueix el rendiment de l’assaig i disminueix la seva sensibilitat. L’assaig optimitzat requereix la inducció de les mostres mitjançant IPTG 0.2 mM durant 180 minuts. La permeabilització de les mostres és necessària, ja que la seva absència provoca una reducció de gairebé el 60% en el rendiment de l’assaig. L’elecció del substrat enzimàtic és fonamental ja que diferents substrats produeixen productes amb diferents coeficients d’extinció o rendiments de fluorescència. La concentració del substrat utilitzat ha de ser prou elevada (al voltant de 3 a 4 vegades Km) per garantir que l’activitat mesurada no estigui limitada pel substrat. Finalment, com que el color / fluorescència dels productes de reacció depèn molt del pH, s’ha de procurar que el pH en el moment de la lectura sigui prou elevat per proporcionar la màxima senyal. L’assaig es realitza en plaques de 96 pous, utilitza MUG (4-metilumberliferil-ß-D-galactopiranosid) com a substrat enzimàtic i té una durada total de 90 minuts. El mètode és capaç de detectar 75 cèl·lules d’E. coli. En les condicions de l’assaig, això correspon a una concentració d’1.49·10^3 cèl·lules·mL-1 de mostra. Per a l’anàlisi de mostres de camp es va desenvolupar una versió ampliada de l’assaig que incorpora passos de preconcentració i preincubació amb una durada total de 7.5 hores. Quan es va provar amb mostres de camp i es va comparar amb Colilert-18, el mètode ampliat va tenir un bon rendiment amb un límit de detecció de 96 cèl·lules·100 mL-1. L’assaig és robust i es pot modificar per adaptar-lo a formats més fàcils d’utilitzar, com ara un assaig en paper.

Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), la contaminación fecal de agua potable afecta a más de 2.000 millones de personas en todo el mundo y provoca más de 500.000 muertes cada año. La estrategia actual para el control de la calidad microbiológica del agua dependen en gran medida del uso de métodos de cultivo bien validados que proporcionan buenos resultados, pero que requieren tiempos largos de incubación. La tendencia en este campo ha sido la introducción progresiva de métodos alternativos rápidos que proporcionan resultados en una fracción del tiempo y permiten una gestión más ágil de los riesgos asociados al agua de consumo. Estos métodos incluyen aproximaciones basadas en la utilización de ácidos nucleicos (PCR, qPCR), reacciones basadas en anticuerpos o aptámeros (ELISA) o ensayos enzimáticos específicos (ATPasa, ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa). Aunque estos métodos ofrecen un resultado bastante bueno, a menudo sufren de una serie de inconvenientes. En la mayoría de los casos, los métodos requieren reactivos caros, el uso de equipos sofisticados o la participación de personal altamente cualificado. Por lo tanto, la búsqueda de un método sencillo, rápido y específico para la detección de E. coli en muestras de agua continúa abierta. Esta tesis intenta contribuir a esta búsqueda desarrollando un método basado en enzimas que utiliza un ensayo inespecífico para β-galactosidasa optimizado para proporcionar una detección específica de E. coli mediante el uso de un bacteriófago T4. La optimización del ensayo de ß-galactosidasa para conseguir la máxima sensibilidad ha requerido la determinación de valores óptimos para los principales parámetros que afectan su rendimiento. Los resultados proporcionan una estima aproximada de cómo la desviación de los valores óptimos reduce el rendimiento del ensayo y disminuye su sensibilidad. El ensayo optimizado requiere la inducción de las muestras mediante IPTG 0.2 mM durante 180 minutos. La permeabilización de las muestras es necesaria, ya que su ausencia provoca una reducción de casi el 60% en el rendimiento del ensayo. La elección del sustrato enzimático es fundamental ya que diferentes sustratos producen productos con diferentes coeficientes de extinción o rendimientos de fluorescencia. La concentración del sustrato utilizado debe ser lo suficientemente elevada (alrededor de 3 a 4 veces Km) para garantizar que la actividad medida no esté limitada por el sustrato. Finalmente, dado que el color / fluorescencia de los productos de reacción depende mucho del pH, se debe procurar que el pH en el momento de la lectura sea suficientemente elevado como para proporcionar la máxima señal. El ensayo se realiza en placas de 96 pozos, utiliza MUG (4-metilumberliferil-ß-D-galactopiranosido) como sustrato enzimático y tiene una duración total de 90 minutos. El método es capaz de detectar 75 células de E. coli. En las condiciones del ensayo, esto corresponde a una concentración de 1.49·10^3 células·mL-1 de muestra. Para el análisis de muestras de campo se desarrolló una versión ampliada del ensayo que incorpora pasos de preconcentración y preincubación con una duración total de 7.5 horas. Cuando se probó con muestras de campo y se comparó con Colilert-18, el método ampliado tuvo un buen rendimiento con un límite de detección de 96 células·100 mL-1. El ensayo es robusto y se puede modificar por adaptarlo a formatos más fáciles de utilizar, como un ensayo en papel.

According to WHO (World Health Organization) fecal contamination of drinking water affects more than 2 billion people worldwide and results in more than 500.000 deaths every year. Current approaches for microbiological water quality monitoring rely heavily on the use of true and tested culture-based methods that provide good results but require long incubation times. The growing trend in this field has been the progressive introduction of alternative fast methods that can provide results in a fraction of the time, allowing for a more agile management of waterborne hazards. These methods include nucleic acid-based approaches (PCR, qPCR), antibody or aptamer-based reactions (ELISA) or specific enzyme assays (ATPase, ß-galactosidase, ß-glucuronidase). Although these methods provide remarkably good result, they are often plagued by a host of problems. In most cases the methods require expensive reagents, the use of sophisticated equipment, or the participation of highly skilled personnel. Therefore, the quest for a simple, fast and specific method for the detection of E. coli in water samples remains open. This thesis tries to contribute to this quest by developing an enzyme-based method that uses an optimized nonspecific ß-galactosidase assay to provide specific detection of E. coli through the use of a T4 phage. Optimizing the ß-galactosidase assay to achieve maximum sensitivity has required the determination of optimal values for the main parameters affecting its performance. The results provide a rough estimate of how departure from optimal values reduces the output of the assay potentially decreasing its sensitivity. The optimized assay requires induction of the samples using 0.2 mM IPTG during 180 minutes. Permeabilization of the samples is mandatory as lack of it results in an almost 60% reduction in assay output. The choice of enzyme substrate is critical as different substrates yield products with different extinction coefficients or fluorescence yields. The concentration of substrate used must be high enough (around 3 to 4 times Km) to ensure that the activity measured is not substrate-limited. Finally, as the color/fluorescence of the reaction products is highly dependent on pH, care must be taken to ensure that pH at the time of reading is high enough to provide maximum signal. The assay is performed in 96 well plates, uses MUG (4-methylumberlliferyl-ß-D-galactopyranoside) as the enzyme substrate and has a total length of 90 minutes. The method is able to detect 75 cells of E. coli. Under the conditions of the assay this corresponds to a concentration of 1.49·10^3 cells·mL-1 of sample. For the analysis of field samples, we produced an extended version of the assay that incorporates preconcentration and preincubation steps with a total running length of 7.5 hours. When tested with field samples and compared with Colilert-18, the extended method performed well with a limit of detection of 96 cells·100 mL-1. The assay is robust and has the potential to be further modified and adapted to user friendly formats such as a paper-based assay.