Refinement of Marble Burying Test to Model Behavioral and Neuropsychiatric Symptoms: Studies in Two Animal Models

Abstract

La prova d’enterrament de marbre (MB) es fa servir per avaluar el comportament d’enterrament en rosegadors. Inicialment, aquesta prova va ser validada farmacològicament per a mesurar conductes ansioses i el tamisatge farmacològic ansiolític. No obstant això, hi havia controvèrsia respecte a la seva especificitat, ja que també es va proposar per modelar conductes repetitives i/o perseverants, símptomes del trastorn obsessivocompulsiu (TOC). Actualment també es proposa modelar el comportament repetitiu exhibit en els trastorns de l’espectre autista (TEA).

Però la preocupació més gran és si MB és una prova fiable per modelar qualsevol símptoma conductual i/o neuropsiquiàtric (BNPS). Les principals són les inconsistències metodològiques, una àmplia varietat de BNPS modelats basant-se únicament en una sola variable i la manca d’hipòtesis sòlides que justifiquin l’atribució d’aquestes construccions, els efectes contradictoris de les drogues i l’absència de neurocircuits ben definits i provats que expliquin el comportament de soterrar. Per tant, la confiança de MB en el modelatge de qualsevol BNPS es qüestiona seriosament. Però no la prova en si, sinó com s’hi aplica, executa i informa.

En aquest escenari, en aquesta tesi brindem una proposta per superar aquest problema basada en la implementació de canvis metodològics, noves variables i hipòtesis multicriteri. El nostre objectiu és validar experimentalment aquesta proposta per millorar les capacitats de detecció de MB BNPS i després proporcionar una demostració pràctica de l’aplicació d’aquestes modificacions per facilitar-ne i fomentar-ne l’ús.

Aquesta tesi es divideix en dues fases experimentals independents que aborden l’aplicació de MB com a cribratge de BNPS en dos escenaris diferents: 1) un model de ratolins mutants amb fenotip conductual desconegut amb altes possibilitats de presentar un fenotip ansiós, els ratolins PDK1 K465E KI, que va ser descrit aquí per primera vegada; i 2) un model de ratolins transgènics per a la malaltia d’Alzheimer amb fenotip ansiós i també augment de l’enterrament, els ratolins 3xTg-AD. Els resultats obtinguts a cada fase van respondre preguntes específiques dels respectius models animals emprats.

Posteriorment, es va integrar l’evidència recol·lectada a les dues fases per abordar els objectius generals d’aquesta tesi, brindant les conclusions següents: 1) El genotip és el factor més influent per a l’aparició de diferències fenotípiques ocultes, apareixent el sexe i l’edat/efectes d’envelliment en circumstàncies o en interaccions.; 2) les característiques del comportament d’enterrament de MB fan que sigui incompatible modelar un comportament similar a l’ansietat, fins i tot considerant estratègies d’afrontament diferenciades; 3) les característiques del comportament d’enterrament de MB el converteixen en un comportament repetitiu normal en si mateix, que s’ajusta millor al model de comportaments psiquiàtrics semblants als repetitius; 4) En models animals d’OCD/ASD no relacionats, l’enterrament de MB podria ser necessari per modelar la impulsivitat i l’apatia; 5) És probable que els ratolins que fan certa activitat d’enterrament també presentin una activitat d’excavació similar; la iniciació de totes dues conductes és intencional, exclusiva i correlacionada; i tots dos són la manifestació d’excavacions adreçades a objectius estretament relacionats; 6) Emprar hipòtesis multicriteri al MB, incloses les característiques centrals del BNPS per modelar, facilita la interpretació dels resultats i brinda solidesa a les capacitats de detecció del BNPS; 7) Transformar el MB en una prova multivariable, a través de canvis metodològics i noves variables, proporciona informació significativa sobre el comportament d’enterrament per refutar o acceptar hipòtesis multicriteri; 8) L’aplicació combinada de l’anàlisi de dues zones de les variables d’activitat d’excavació i el curs temporal de bales enterrades al llarg de les proves proporciona la informació d’enterrament més rendible per rebutjar o acceptar hipòtesis multicriteri; 9) Cal emprar una prova repetida de MB depenent de quin BNPS necessiti modelar-se.

La prueba de entierro de mármol (MB) se utiliza para evaluar el comportamiento de entierro en roedores. Inicialmente, esta prueba fue validada farmacológicamente para medir conductas ansiosas y el tamizado farmacológico ansiolítico. Sin embargo, existía controversia respecto a su especificidad, ya que también se propuso para modelar conductas repetitivas y/o perseverantes, síntomas del trastorno obsesivo-compulsivo (TOC). Actualmente también se propone moldear el comportamiento repetitivo exhibido en los trastornos del espectro autista (TEA).

Pero la mayor preocupación es si MB es una prueba fiable para modelar cualquier síntoma conductual y/o neuropsiquiátrico (BNPS). Las principales son las inconsistencias metodológicas, una amplia variedad de BNPS moldeados basándose únicamente en una sola variable y la falta de hipótesis sólidas que justifiquen la atribución de estas construcciones, los efectos contradictorios de las drogas y la ausencia de neurocircuitos bien definidos y probados que expliquen el comportamiento de enterrar. Por tanto, la confianza de MB en el modelado de cualquier BNPS se cuestiona en serio. Pero no la prueba en sí, sino cómo se aplica, ejecuta e informa.

En este escenario, en esta tesis brindamos una propuesta para superar este problema basada en la implementación de cambios metodológicos, nuevas variables e hipótesis multicriterio. Nuestro objetivo es validar experimentalmente esta propuesta para mejorar las capacidades de detección de MB BNPS y después proporcionar una demostración práctica de la aplicación de estas modificaciones para facilitar y fomentar su uso.

Dos fases experimentales independientes abordan la aplicación de MB como cribado de BNPS en dos escenarios diferentes: 1) un modelo de ratones mutantes con fenotipo conductual desconocido con altas posibilidades de presentar un fenotipo ansioso, los ratones PDK1 K465E KI, que fue descrito aquí por primera vez; y 2) un modelo transgénico para la enfermedad de Alzheimer con fenotipo ansioso y también aumento del entierro, los ratones 3xTg-AD.

Posteriormente, se integró la evidencia recolectada en las dos fases para abordar los objetivos generales de esta tesis, brindando las siguientes conclusiones: 1) El genotipo es el factor más influyente para la aparición de diferencias fenotípicas ocultas, apareciendo el sexo y la edad/efectos de envejecimiento en circunstancias o en interacciones.; 2) las características del comportamiento de entierro de MB hacen que sea incompatible modelar un comportamiento similar a la ansiedad, incluso considerando estrategias de afrontamiento diferenciadas; 3) las características del comportamiento de entierro de MB lo convierten en un comportamiento repetitivo normal en sí mismo, que se ajusta mejor al modelo de comportamientos psiquiátricos similares a los repetitivos; 4) En modelos animales de OCD/ASD no relacionados, el entierro de MB podría ser necesario para modelar la impulsividad y la apatía; 5) Es probable que los ratones que realizan cierta actividad de entierro también presenten una actividad de excavación similar; la iniciación de ambas conductas es intencional, exclusiva y correlacionada; y ambos son la manifestación de excavaciones dirigidas a objetivos estrechamente relacionados; 6) Emplear hipótesis multicriterio en el MB, incluidas las características centrales del BNPS para modelar, facilita la interpretación de los resultados y brinda solidez a las capacidades de detección del BNPS; 7) Transformar el MB en una prueba multivariable, a través de cambios metodológicos y nuevas variables, proporciona información significativa sobre el comportamiento de entierro para refutar o aceptar hipótesis multicriterio; 8) La aplicación combinada del análisis de dos zonas de las variables de actividad de excavación y el curso temporal de balas enterradas a lo largo de las pruebas proporciona la información de entierro más rentable para rechazar o aceptar hipótesis multicriterio; 9) Hay que utilizar una prueba repetida de MB dependiendo de qué BNPS necesite moldearse.

Marble Burying Test (MB) is a commonly used in neuroscience to assess burying behavior in rodents. Initially, this test was pharmacologically validated for its use to measure anxiety-related behaviors and screening for anxiolytic pharmacological. However, controversy existed regarding its specificity as it was also proposed to model better repetitive and/or perseverative behaviors manifested in obsessive-compulsive disorder (OCD) symptoms. Currently, is also proposed to model repetitive behavior exhibited in autism spectrum disorders (ASD).

But the debate is no longer whether marble burying mimics anxiety-like or compulsive-like disorders. Nowadays, the major concern is whether MB is a reliable test to model any behavioral and/or neuropsychiatric symptom (BNPS). Their major are methodological inconsistencies, a wide variety of BNPS modeled based solely on a single variable and a lack of robust hypothesis to justify the attribution of such constructs, contradictory drug effects, and an absence of well-defined and probed neurocircuitry explaining burying behavior. Hence, MB’s reliability in modeling any BNPS is severely questioned. But not the test itself but how it is applied, executed, and reported.

In this scenario, in this thesis we provide a proposal to overcome this issue based in the implementation of methodological changes, new variables, and multicriteria hypothesis. Our objective is to experimentally validate this proposal to improve MB BNPS screening capabilities and providing then a practical demonstration of the application of such modifications to facilitate and encourage their use.

This thesis is divided into two independent experimental phases that address the application of MB as a BNPS screening in two different scenarios: 1) a mutant mice model with unknown behavioral phenotype which high possibilities of exhibiting an anxious phenotype, the PDK1 K465E KI mice, that was described here for the first time; and 2) a transgenic mice model for Alzheimer Disease with anxious phenotype and also increased burying, the 3xTg-AD mice. Results obtained in each phase answered specific questions of the respective animal models employed.

Subsequently, the collected evidence in the two phases was integrated to address the general objectives of this thesis, providing the following conclusions: 1) Genotype is the most influential factor for the appearance of burying phenotypic differences, appearing sex and age/ageing effects in specific circumstances or in interactions.; 2) MB burying behavior features make it incompatible to model an anxiety-like behavior, even considering differentiated coping-strategies; 3) MB burying behavior features make it a normal repetitive behavior by itself, fitting better to model psychiatrics repetitive-like behaviors; 4) In non-related OCD/ASD animal models, MB burying could be accurate to model impulsivity and apathy; 5) Mice that perform a certain of burying activity are likely also to present a similar burrowing activity; the initiation of both behaviors is intentional, exclusive, and correlated; and both are the manifestation of closely related goal-directed diggings; 6) Employing multicriteria hypothesis in the MB, including core features of the BNPS to model, facilitates the interpretation of the results and provides robustness to it BNPS screening capabilities; 7) Transforming the MB in a multivariable test, through methodological changes and new variables, provides meaningful burying behavior insights to refute or accept multicriteria hypotheses; 8) The combined application of the two-zone analysis of digging activity variables and the time-course of marbles buried along the tests provide the most profitable burying information to reject or accept multicriteria hypotheses; 9) MB repeated trial should be employed depending on which BNPS needs to be modeled.