Experimental models in non-alcoholic steatohepatitis and effects of therapeutic strategies based on gut microbiota

Abstract

La malaltia de fetge gras no alcohòlic (EHGNA) i la seva forma progressiva, la esteatohepatitis no alcohòlica (EHNA), constitueixen avui dia, un important problema de salut pública. Actualment no existeixen teràpies aprovades que permetin revertir la progressió de la EHNA pel que ens veiem en la necessitat de buscar nous tractaments i d’identificar i desenvolupar nous models preclínics que imitin tan bé com sigui possible la patologia en humans. La microbiota intestinal ha estat objecte de gran interès en els últims anys a causa de la seva associació amb els trastorns metabòlics, incloent-hi la EHGNA. Per tant, l’ús de teràpies basades en microbiota intestinal per al tractament o la prevenció de la EHGNA, s’ha considerat com una aproximació interessant. Aquesta tesi és la continuació d’un treball previ del nostre grup, en el qual un model de EHNA en rata induït per una dieta de 8 setmanes alta en greixos i en glucosa i fructosa (HFGFD), ens va permetre dilucidar el vincle entre la resistència a la insulina (IR), la disfunció endotelial i la microbiota intestinal en el desenvolupament de la hipertensió portal (HP), en absència de fibrosi. En primer lloc, ens vam proposar avaluar la persistència de la HP i els mecanismes subjacents en un model de rata induït per la dieta HFGFD durant 36 setmanes. Trobem que, el greix hepàtic per se (en absència de disfunció endotelial o fibrosi), és capaç d’induir HP a causa d’un marcat augment de l’àrea dels hepatòcits que promou la reducció mecànica de l’àrea sinusoidal hepàtica. En segon lloc, tenint en compte que el nostre grup va demostrar una millora de la HP mitjançant el trasplantament de microbiota fecal (TMF), utilitzem una combinació microbiana de composició definida, com una alternativa més confortable per al pacient, per a provar els seus efectes en dos models in vivo de EHNA en rosegadors: un model de rata induït per la dieta HFGFD durant 8 setmanes i el model de ratolí STAM™. En les rates amb EHNA, es va observar una millora de la HP i de la funció endotelial. Els canvis en la composició microbiana intestinal també van revelar que la combinació bacteriana va aconseguir una substitució més definida i rica de la microbiota que el TMF. A més, la transcriptómica hepàtica va suggerir una regulació beneficiosa de les vies profibrogèniques. En el model de ratolí STAM™, es va confirmar la millora de la fibrosi histològica, reduint-se significativament les àrees positives en col·lagen i fibronectina en fetge a les 12 setmanes. La combinació bacteriana també va disminuir l’activitat EHGNA (NAS, de l’anglès NAFLD Activity Score), d’acord amb una disminució de la esteatosi i de la balonización hepatocitaria. A més, va disminuir la inflamació (mitjançant la reducció de l’àrea positiva F4/80 dels macròfags) i l’apoptosi (mitjançant la reducció dels nivells sèrics de citoquetatina-18). Per tant, l’administració d’una combinació bacteriana específica de composició definida pot millorar la EHNA, la HP i la fibrosi, i retardar la progressió de la malaltia. Finalment, desenvolupem un model de rata (denominat model FIBRO-SH) que va seguir una dieta alta en greixos, en colesterol i en glucosa i fructosa (HFHC/GF) durant 16 setmanes per a reproduir el fenotip complet de EHGNA amb fibrosi. La intervenció de la dieta HFHC/GF durant 16 setmanes va ser capaç d’induir un augment de l’activitat de EHNA amb una marcada fibrosi hepàtica, una HP significativa i disfunció endotelial promoguda per IR hepàtica. En conclusió, el model FIBRO-SH podria convertir-se en un model adequat per a la recerca bàsica de les fases avançades de la EHGNA i per a provar teràpies antifibròtiques en aquesta patologia.

La enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) y su forma progresiva, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), constituyen hoy en día, un importante problema de salud pública. Actualmente no existen terapias aprobadas que permitan revertir la progresión de la EHNA por lo que nos vemos en la necesidad de buscar nuevos tratamientos y de identificar y desarrollar nuevos modelos preclínicos que imiten lo mejor posible la patología en humanos. La microbiota intestinal ha sido objeto de gran interés en los últimos años debido a su asociación con los trastornos metabólicos, incluyendo la EHGNA. Por lo tanto, el uso de terapias basadas en microbiota intestinal para el tratamiento o la prevención de la EHGNA, se ha considerado como una aproximación interesante. Esta tesis es la continuación de un trabajo previo de nuestro grupo, en el que un modelo de EHNA en rata inducido por una dieta de 8 semanas alta en grasas y en glucosa y fructosa (HFGFD), nos permitió dilucidar el vínculo entre la resistencia a la insulina (IR), la disfunción endotelial y la microbiota intestinal en el desarrollo de la hipertensión portal (HP), en ausencia de fibrosis. En primer lugar, nos propusimos evaluar la persistencia de la HP y los mecanismos subyacentes en un modelo de rata inducido por la dieta HFGFD durante 36 semanas. Encontramos que, la grasa hepática per se (en ausencia de disfunción endotelial o fibrosis), es capaz de inducir HP debido a un marcado aumento del área de los hepatocitos que promueve la reducción mecánica del área sinusoidal hepática. En segundo lugar, teniendo en cuenta que nuestro grupo demostró una mejora de la HP mediante el trasplante de microbiota fecal (TMF), utilizamos una combinación microbiana de composición definida, como una alternativa más confortable para el paciente, para probar sus efectos en dos modelos in vivo de EHNA en roedores: un modelo de rata inducido por la dieta HFGFD durante 8 semanas y el modelo de ratón STAM™. En las ratas con EHNA, se observó una mejora de la HP y de la función endotelial. Los cambios en la composición microbiana intestinal también revelaron que la combinación bacteriana logró una sustitución más definida y rica de la microbiota que el TMF. Además, la transcriptómica hepática sugirió una regulación beneficiosa de las vías profibrogénicas. En el modelo de ratón STAM™, se confirmó la mejora de la fibrosis histológica, reduciéndose significativamente las áreas positivas en colágeno y fibronectina en hígado a las 12 semanas. La combinación bacteriana también disminuyó la actividad EHGNA (NAS, del inglés NAFLD Activity Score), en consonancia con una disminución de la esteatosis y de la balonización hepatocitaria. Además, disminuyó la inflamación (mediante la reducción del área positiva F4/80 de los macrófagos) y la apoptosis (mediante la reducción de los niveles séricos de citoquetatina-18). Por lo tanto, la administración de una combinación bacteriana específica de composición definida puede mejorar la EHNA, la HP y la fibrosis, y retrasar la progresión de la enfermedad. Por último, desarrollamos un modelo de rata (denominado modelo FIBRO-SH) que siguió una dieta alta en grasas, en colesterol y en glucosa y fructosa (HFHC/GF) durante 16 semanas para reproducir el fenotipo completo de EHGNA con fibrosis. La intervención de la dieta HFHC/GF durante 16 semanas fue capaz de inducir un aumento de la actividad de EHNA con una marcada fibrosis hepática, una HP significativa y disfunción endotelial promovida por IR hepática. En conclusión, el modelo FIBRO-SH podría convertirse en un modelo adecuado para la investigación básica de las fases avanzadas de la EHGNA y para probar terapias antifibróticas en esta patología.

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its progressive form non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are currently a major public health concern. The current lack of approved therapies encourages to search for new treatments that allow reversing the progression of NASH, and there is an ongoing challenge to identify preclinical models that best mimic human pathology. The gut microbiota has gained much attention in the past few years because of its association with metabolic disorders, including NAFLD. Therefore, the use of gut microbial approaches could be considered for treatment or prevention of NAFLD. This thesis follows previous work of our group, in which a rat model of NASH without fibrosis induced by a high-fat glucose-fructose diet (HFGFD) for 8 weeks, allowed us to elucidate the link between insulin resistance (IR), endothelial dysfunction and the gut microbiota in the development of portal hypertension (PH). Here, we first aimed to evaluate the persistence of PH and underlying mechanisms in a 36-week HFGFD-induced rat model. We found that, liver fat per se (in the absence of endothelial dysfunction or fibrosis), is able to induce PH due to a marked increase in the hepatocyte area that promotes the mechanical reduction of the hepatic sinusoidal area. Second, considering that our group demonstrated an amelioration on PH by fecal microbiota transplantation (FMT), we used a microbial consortia of defined composition, as a more patient-friendly approach, to test its effects in two in vivo rodent models of NASH: an 8-week HFGFD-induced rat model, and the STAM™ mouse model. In the NASH rats, an improvement of PH and endothelial function was observed. Gut microbial compositional changes also revealed that the consortium achieved a more defined and richer replacement of the gut microbiome than FMT. Moreover, liver transcriptomics suggested a beneficial modulation of pro-fibrogenic pathways. An improvement in histological liver fibrosis was then confirmed in the STAM™ study, significantly reducing collagen- and fibronectin-positive areas in liver sections at 12 weeks. The bacterial consortium also improved the NAFLD activity score (NAS), consistent with a decrease in steatosis and ballooning. Inflammation (as measured through macrophage F4/80 positive area) and apoptosis (reduction in serum cytokeratin 18 levels) were also reduced. Therefore, administration of a specific bacterial consortium of defined composition can ameliorate NASH, PH and fibrosis, and delay disease progression. Finally, we developed a rat model (termed FIBRO-SH rat model) following a high-fat high-cholesterol glucose-fructose diet (HFHC/GF) during 16 weeks in order to reproduce the full NAFLD phenotype with fibrosis. The 16-week HFHC/GF intervention was able to induce increased NAS with marked histological liver fibrosis, significant PH and endothelial dysfunction promoted by hepatic IR. In conclusion, the FIBRO-SH rat model could become a suitable model for basic research on the advanced stages of NAFLD and for testing anti-fibrotic therapies in this pathology.