Rice as a production platform for valuable metabolites and recombinant pharmaceuticals for human health

Abstract

La meva tesi doctoral analitza l'ús del genotip d'arròs espanyol modificat genèticament Bomba com a plataforma per a la producció de metabòlits valuosos i proteïnes recombinants per a aplicacions en salut humana. Els quatre capítols presenten diferents estratègies d'enginyeria genètica per millorar el contingut de carotenoides i l'expressió de proteïnes recombinants en l'arròs, amb innovacions que donen suport tant a la biofortificació nutricional com a la producció farmacèutica. Els tres primers capítols se centren en l'acumulació de β-carotè en el call i les llavors d'arròs, utilitzant 6M PSY1 i PDS, 6M PSY1 i CRTI, i un oligonucleòtid de 119 pb dissenyat per corregir el promotor PSY1 i PDS, respectivament, mitjançant l'estratègia d'activació SLEEPERs. Aquesta estratègia aprofita els “Promotors Silenciosos i Latents Activats en l’Endosperma” (SLEEPERs), mitjançant els quals el promotor PSY1 s’activa corregint elements cis-reguladors específics de l’endosperma. Al primer capítol, vaig identificar elements cis-actius gairebé funcionals en el promotor PSY1, que codifica l’enzim responsable del primer pas en la biosíntesi de carotenoides, però que està inactiu en l’endosperma. Es van modificar sis motius dins d’una regió de 120 pb, aproximadament a 300 pb aigües amunt del lloc d’inici de la transcripció, perquè coincidissin amb elements funcionals del promotor actiu BCH2 en l’endosperma. El promotor resultant, 4M, va aconseguir conduir l’expressió de GFP en el call i les llavors de plantes transgèniques, però no va aconseguir activar l’expressió de PSY1. Alternativament, vaig descriure una estratègia que combina el gen PSY1, regulat pel seu promotor endogen amb sis elements cis corregits, i el gen PDS, controlat pel promotor específic de teixit p-Hordein. Aquest enfocament va buscar desenvolupar línies d’arròs transgènic que coexpressessin ambdós gens per augmentar l’acumulació de carotenoides a l’endosperma de l’arròs. Al segon capítol, vaig observar que l’estratègia SLEEPERs va augmentar amb èxit l’expressió de PSY1 i, juntament amb PDS, va permetre l’acumulació de β-carotè en el call, però no en les llavors. Per abordar això, vaig substituir PDS pel gen bacterià CRTI. CRTI codifica un enzim que converteix el fitè en licopè, evitant múltiples enzims vegetals i millorant l’acumulació de carotenoides a l’endosperma de l’arròs. El tercer capítol explora el potencial de la mutagènesi dirigida per oligonucleòtids (ODM, per les seves sigles en anglès) per corregir els mateixos sis elements cis en el promotor PSY1. Utilitzant un oligonucleòtid sintètic que conté aquests elements en una configuració activa, l’estratègia buscava promoure l’acumulació de β-carotè a l’endosperma de l’arròs. Tot i que ODM no va aconseguir les modificacions desitjades, els resultats destaquen tant el potencial com els desafiaments d’aplicar aquesta tècnica en sistemes vegetals. Aquests desafiaments inclouen l’eficiència en el lliurament dels oligonucleòtids a les cèl·lules vegetals, garantir un direccionament precís i superar els mecanismes naturals de reparació de les plantes, que poden contrarestar les edicions previstes. Al capítol final, vaig investigar l’ús de l’arròs com a plataforma per a la producció de proteïnes farmacèutiques recombinants, un projecte desenvolupat en resposta a la pandèmia de SARS-CoV-19. Es va establir l’expressió del domini d’unió al receptor (RBD) de la proteïna espícula (S1) del SARS-CoV-19 en call d’arròs. La proteïna es va dirigir a l’apoplast i la seva purificació es va facilitar mitjançant una etiqueta d’histidina 6x. L’anàlisi de glicosilació de la proteïna RBD va revelar perfils de glicans diferents en comparació amb altres sistemes vegetals, cosa que subratlla el potencial de l’arròs com a plataforma per a la producció de proteïnes biofarmacèutiques amb configuracions de glicans específiques adequades per a diverses aplicacions mèdiques.

Mi tesis doctoral analiza el uso del genotipo de arroz español genéticamente modificado Bomba como plataforma para la producción de metabolitos valiosos y proteínas recombinantes para aplicaciones en salud humana. Los cuatro capítulos presentan diferentes estrategias de ingeniería genética para mejorar el contenido de carotenoides y la expresión de proteínas recombinantes en el arroz, con innovaciones que apoyan tanto la biofortificación nutricional como la producción farmacéutica. Los tres primeros capítulos se centran en la acumulación de β-caroteno en el callo y las semillas de arroz, utilizando 6M PSY1 y PDS, 6M PSY1 y CRTI, y un oligonucleótido de 119 pb diseñado para corregir el promotor PSY1 y PDS, respectivamente, empleando la estrategia de activación SLEEPERs. Esta estrategia aprovecha los “Promotores Silenciosos y Latentes Activados en el Endospermo” (SLEEPERs), mediante los cuales el promotor PSY1 se activa corrigiendo elementos cis-reguladores específicos del endospermo. En el primer capítulo, identifiqué elementos cis-activos casi funcionales en el promotor PSY1, que codifica la enzima responsable del primer paso en la biosíntesis de carotenoides, pero que está inactivo en el endospermo. Se modificaron seis motivos dentro de una región de 120 pb, aproximadamente a 300 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción, para que coincidieran con elementos funcionales del promotor activo BCH2 en el endospermo. El promotor resultante, 4M, logró conducir la expresión de GFP en el callo y las semillas de plantas transgénicas, pero no logró activar la expresión de PSY1. Alternativamente, describí una estrategia que combina el gen PSY1, regulado por su promotor endógeno con seis elementos cis corregidos, y el gen PDS, controlado por el promotor específico de tejido p-Hordein. Este enfoque buscó desarrollar líneas de arroz transgénico que coexpresaran ambos genes para aumentar la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz. En el segundo capítulo, observé que la estrategia SLEEPERs aumentó con éxito la expresión de PSY1 y, junto con PDS, permitió la acumulación de β-caroteno en el callo, pero no en las semillas. Para abordar esto, sustituí PDS por el gen bacteriano CRTI. CRTI codifica una enzima que convierte fiteno en licopeno, evitando múltiples enzimas vegetales y mejorando la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz. El tercer capítulo explora el potencial de la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (ODM, por sus siglas en inglés) para corregir los mismos seis elementos cis en el promotor PSY1. Usando un oligonucleótido sintético que contiene estos elementos en una configuración activa, la estrategia buscó promover la acumulación de β-caroteno en el endospermo del arroz. Aunque ODM no logró las modificaciones deseadas, los resultados destacan tanto el potencial como los desafíos de aplicar esta técnica en sistemas vegetales. Estos desafíos incluyen la eficiencia en la entrega de los oligonucleótidos a las células vegetales, garantizar un direccionamiento preciso y superar los mecanismos naturales de reparación de las plantas, que pueden contrarrestar las ediciones previstas. En el capítulo final, investigué el uso del arroz como plataforma para la producción de proteínas farmacéuticas recombinantes, un proyecto desarrollado en respuesta a la pandemia de SARS-CoV-19. Se estableció la expresión del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espiga (S1) del SARS-CoV-19 en callo de arroz. La proteína se dirigió al apoplasto y su purificación se facilitó mediante una etiqueta de histidina 6x. El análisis de glicosilación de la proteína RBD reveló perfiles de glicanos distintos en comparación con otros sistemas vegetales, lo que subraya el potencial del arroz como plataforma para la producción de proteínas biofarmacéuticas con configuraciones de glicanos específicas adecuadas para diversas aplicaciones médicas.

My doctoral dissertation discusses the use of genetically modified Spanish rice genotype Bomba as a platform for producing valuable metabolites and recombinant proteins for human health applications. The four chapters present different genetic engineering strategies to enhance carotenoid content and recombinant protein expression in rice, with innovations supporting both nutritional biofortification and pharmaceutical production. The first three chapters focus on β-carotene accumulation in rice callus and seeds, employing 6M PSY1 and PDS, 6M PSY1 and CRTI, and a 119-bp Oligonucleotide aimed at correcting the PSY1 promoter and PDS, respectively, while using the SLEEPERs activation strategy. This strategy leverages “Silent Latent Endosperm Enabled Promoters” (SLEEPERs), whereby the PSY1 promoter is activated by correcting endosperm-specific near-miss cis-regulatory elements. In the first chapter, I identified near-miss cis-acting elements in the PSY1 promoter, which encodes the enzyme for the first step in carotenoid biosynthesis but is inactive in the endosperm. Six motifs within a 120-bp region, approximately 300 bp upstream of the transcriptional start site, were modified to match functional elements from the endosperm-active BCH2 promoter. The resulting 4M promoter successfully drove GFP expression in callus and seeds of transgenic plants but failed to activate PSY1 expression. Alternatively, I described a strategy that combines the PSY1 gene, regulated by its endogenous promoter with six corrected cis-acting elements, and the PDS gene, controlled by the tissue-specific p-hordein promoter. This approach aimed to develop transgenic rice lines co-expressing both genes to enhance carotenoid accumulation in the rice endosperm. In the second chapter, I observed that the SLEEPERs strategy successfully increased PSY1 expression and, together with PDS, enabled β-carotene accumulation in callus but not in seeds. To address this, I replaced PDS with the bacterial CRTI gene. CRTI encodes an enzyme that converts phytoene to lycopene, bypassing multiple plant enzymes and enhancing carotenoid accumulation in rice endosperm. The third chapter explores the potential of Oligo-Directed Mutagenesis (ODM) to correct the same six cis-acting elements in the PSY1 promoter. Using a synthetic oligonucleotide containing these elements in an active configuration, the strategy aimed to promote β-carotene accumulation in the rice endosperm. While ODM did not succeed in achieving the desired modifications, the results underscore both the potential and the challenges of applying this technique in plant systems. These challenges include efficiency in delivering oligonucleotides to plant cells, ensuring precise targeting, and overcoming the plant's natural repair mechanisms, which can counteract the intended edits. In the final chapter, I investigated the use of rice as a platform for recombinant pharmaceutical protein production, a project developed in response to the SARS-CoV-19 pandemic. The expression of the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-19 spike (S1) protein in rice callus was established. The protein was targeted to the apoplast and purification was facilitated using a 6x histidine tag. Glycosylation analysis of the RBD protein revealed distinct glycan profiles compared to other plant systems, underscoring rice’s potential as a platform for producing bio-pharmaceutical proteins with tailored glycan configurations suitable for diverse medical applications.