Approaches to study the pig nasal microbiota in the context of the host

Abstract

La microbiota animal és la comunitat ecològica de microorganismes que viuen en múltiples llocs del cos. En particular, la microbiota nasal té un paper important en la salut de l’hoste, ja que constitueix una barrera en front els patògens respiratoris. Les interaccions entre els bacteris comensals de la cavitat nasal dels garrins i amb l’epiteli nasal són determinants per a l’exclusió dels patògens. Tanmateix, no hi ha cap metodologia disponible per estudiar aquestes interaccions de manera sistemàtica. La present tesi proporciona noves eines per explorar la microbiota nasal del porc en el context del seu hoste. Inicialment, es va estudiar si l’efecte d’un tractament intensiu amb antibiòtics a les truges podia evitar la transferència de la microbiota nasal als seus garrins, ja que estudis previs han demostrat que les truges són la principal font de microbiota pels garrins. El tractament de les truges amb ceftiofur sol o en combinació amb tulatromicina va reduir la càrrega bacteriana a la cavitat nasal de les truges i dels garrins, causant una disbiosi en la microbiota nasal dels garrins la qual presentava taxons inusuals. No obstant això, la transmissió de la microbiota no es va evitar completament, fet que limita l’ús d’aquest model per a estudis de microbiota. Per això, calen estratègies addicionals per desenvolupar garrins germ-free, assegurant alhora que les condicions siguin fàcils d’implementar. A continuació, ens vam proposar establir models in vitro per estudiar la xarxa de la microbiota nasal dels garrins. Per això, es va desenvolupar el consorci nasal porcí PNC8 (Porcine Nasal Consortium), una comunitat sintètica dissenyada racionalment amb 8 soques que representen els gèneres més prevalents i/o abundants de la microbiota nasal de garrins sans. Vam observar que els membres de PNC8 diferien en la seva capacitat per créixer en 23 condicions in vitro diferents, cosa que suggereix que tenen funcions metabòliques diferents. A més, vam confirmar l’existència d’interaccions, com la cooperació entre Rothia nasimurium i Staphylococcus aureus amb Glaesserella parasuis (tant soques virulentes com no virulentes). En conclusió, el PNC8 és una eina valuosa per examinar la xarxa d’interaccions en la microbiota nasal dels garrins sota condicions in vitro definides, així com per entendre el seu paper en l’exclusió de patògens respiratoris. Per tal d’explorar la interacció entre la microbiota nasal i l’hoste en un sistema in vitro controlat, vam desenvolupar per primera vegada organoides nasals porcins (Porcine Nasal Organoids, PNOs), els quals van mostrar una estructura i tipus cel·lulars similars als de la mucosa nasal del porc. Vam confirmar que alguns membres de PNC8 (Moraxella pluranimalium, R. nasimurium i G. parasuis), així com una soca virulenta de G. parasuis, s’adherien i colonitzaven els PNOs, encara que a diferents nivells. També vam examinar les interaccions microbi-microbi i microbi-hoste en aquest sistema co-cultivant R. nasimurium amb els altres 3 bacteris. A més, els PNOs van reaccionar a la presència de bacteris secretant diferents citocines. M. pluranimalium i G. parasuis van estimular la producció de citocines proinflamatòries, mentre que R. nasimurium va induir la secreció d’INFγ, reduint així l’efecte proinflamatori causat pels altres bacteris. Concloem que els PNOs reprodueixen la mucosa nasal i poden ser útils per estudiar les interaccions hoste-microbi en un sistema semblant al in vivo, contribuint als principis de les 3Rs. En resum, aquesta tesi proporciona noves eines per explorar la microbiota nasal sota condicions controlades que imiten l’ambient in vivo del nas del garrí. Aquest treball contribuirà a entendre el paper de la microbiota en l’exclusió de patògens.

La microbiota animal es la comunidad ecológica de microorganismos que viven en múltiples partes del cuerpo. En particular, la microbiota nasal desempeña un papel importante en la salud del huésped, ya que constituye una barrera contra los patógenos respiratorios. A pesar de que las interacciones entre las bacterias comensales de la cavidad nasal de los lechones y el epitelio nasal son determinantes para la exclusión de patógenos, no existe ninguna metodología para estudiar estas interacciones de una forma sistemática. La presente tesis proporciona nuevas herramientas para explorar la microbiota nasal del cerdo en el contexto del huésped. Inicialmente, se estudió si el efecto de un tratamiento intensivo de antibióticos en cerdas podía evitar la transferencia de microbiota nasal a sus lechones, dado que en previos estudios se ha visto que las cerdas son la principal fuente de microbiota para los lechones. Se observó que un tratamiento con ceftiofur solo o en combinación con tulatromicina reducía la carga bacteriana en la cavidad nasal de cerdas y lechones, causando disbiosis en la microbiota nasal de los lechones, que mostraba taxones inusuales. Sin embargo, la transmisión de la microbiota no se evitó por completo, lo que limita el uso de este modelo para estudios de microbiota. Por ello, se necesitan estrategias adicionales para desarrollar lechones germ-free, asegurando a la vez que las condiciones sean fáciles de implementar. A continuación, nos propusimos establecer modelos in vitro para estudiar la red de interacciones de la microbiota nasal de los lechones. Para ello, se desarrolló el consorcio nasal porcino PNC8 (Porcine Nasal Consortium), una comunidad sintética diseñada racionalmente con 8 cepas que representan los géneros más prevalentes y/o abundantes de la microbiota nasal de lechones sanos. Se observó que los miembros del PNC8 variaban en su capacidad de crecer en 23 condiciones in vitro distintas, sugiriendo que poseen funciones metabólicas diferentes. Además, confirmamos la existencia de interacciones, como la cooperación entre Rothia nasimurium y Staphylococcus aureus con Glaesserella parasuis (tanto cepas virulentas como no virulentas). En conclusión, el PNC8 es una herramienta valiosa para examinar la red de interacciones en la microbiota nasal de los lechones bajo condiciones in vitro definidas, así como para entender su papel en la exclusión de patógenos respiratorios. Para explorar la interacción entre la microbiota nasal y el huésped en un sistema in vitro controlado, se desarrollaron por primera vez organoides nasales porcinos (Porcine Nasal Organoids, PNOs), que mostraron una estructura y tipos celulares similares a los encontrados en la mucosa nasal del cerdo. Confirmamos que algunos miembros de PNC8 (Moraxella pluranimalium, R. nasimurium y G. parasuis), así como una cepa virulenta de G. parasuis, se adherían y colonizaban los PNOs, aunque en distinto grado. También examinamos las interacciones microbio-microbio y microbio-huésped en este sistema, co-cultivando R. nasimurium con las otras 3 cepas. Además, los PNOs reaccionaron a la presencia de bacterias secretando diferentes citocinas. M. pluranimalium y G. parasuis estimularon la producción de citocinas proinflamatorias, mientras que R. nasimurium indujo la secreción de INFγ, reduciendo así el efecto proinflamatorio causado por las otras bacterias. Concluimos que los PNOs representan la mucosa nasal y pueden ser útiles para estudiar interacciones huésped-microbio en un sistema similar al in vivo, contribuyendo a los principios de las 3Rs. En resumen, esta tesis proporciona nuevas herramientas para explorar la microbiota nasal bajo condiciones controladas que imitan el ambiente in vivo de la nariz del lechón. Este trabajo contribuirá a comprender el papel de la microbiota en la exclusión de patógenos.

The animal microbiota is the ecological community of microorganisms living in multiple body sites. In particular, the nasal microbiota plays an important role in host health as it constitutes a barrier for respiratory pathogens. Interactions among the pig nasal commensal bacteria and with the nasal epithelium are determinant for pathogen exclusion, but no systematic approach was available to elucidate such interactions. This thesis provides new tools for exploring the pig nasal microbiota within its host context. First, we studied whether an intensive antibiotic treatment to sows could prevent the transfer of nasal microbiota to piglets, as previous work highlighted that sows are the main source of piglet microbiota. The treatment of sows with ceftiofur alone or in combination with tulathromycin diminished the bacterial load in the nasal cavity of sows and piglets, causing dysbiosis in the piglets’ nasal microbiota, which showed unusual taxa. However, the transmission of the microbiota was not entirely prevented, which limits the use of this piglet model for microbiota studies. Additional strategies are needed to develop germ-free pigs, while ensuring that the conditions remain easy to implement. Next, we aimed to establish in vitro models to study the network of the piglet nasal microbiota. For this, we developed the Porcine Nasal Consortium (PNC8), a rationally designed synthetic community of 8 strains representing the most prevalent and/or abundant genera found in the nasal microbiota of healthy piglets. We found that PNC8 members varied in their ability to grow across 23 different in vitro conditions, which suggests that they harbour distinct metabolic functions. In addition, we confirmed the existence of interactions, such as the cooperation among Rothia nasimurium and Staphylococcus aureus with Glaesserella parasuis (virulent and non-virulent strains). In conclusion, PNC8 represents a valuable tool for examining the interaction network in the piglet nasal microbiota under in vitro defined conditions, as well as to elucidate its role in respiratory pathogen exclusion. To explore the nasal microbiota-host interplay in a controlled in vitro system, we developed for the first time Porcine Nasal Organoids (PNOs), which showed similar structure and cell types than the in vivo pig nasal mucosa. We confirmed that some PNC8 members (Moraxella pluranimalium, R. nasimurium and G. parasuis) as well as a virulent G. parasuis strain adhered and colonized the PNOs, although at different levels. We also examined microbial-microbial and microbial-host interactions in this system by co-culturing R. nasimurium with the remaining 3 strains. Besides, PNOs reacted to the bacteria secreting different cytokines. M. pluranimalium and G. parasuis stimulated the production of proinflammatory cytokines, while R. nasimurium induced the secretion of INFγ and diminished the proinflammatory effect produced by the other bacteria. We conclude that PNOs recapitulate the in vivo nasal mucosa and can be useful to study host-microbe interactions in an in vivo-like system, contributing to the 3Rs principles. In summary, this thesis provides new approaches to explore the nasal microbiota network under controlled conditions that mimic the in vivo environment of the piglet’s nose. This work will contribute to understand the role of microbiota in pathogen exclusion.