Phosphate as a molecular switch in growth–immunity tradeoffs: Insights via phosphite treatment, gene editing, and biosensing

Abstract

Les plantes s’enfronten constantment a un equilibri entre el creixement i la defensa, especialment sota condicions ambientals variables i amb disponibilitat limitada de nutrients. Entre els macronutrients, el fòsfor, absorbit principalment com a fosfat inorgànic (Pi), és essencial no només per al desenvolupament vegetal, sinó també com a regulador de les respostes immunitàries. Diversos estudis han demostrat que els desequilibris nutricionals afecten la resistència a malalties. Aquesta tesi investiga la relació entre l’homeòstasi del fosfat i la immunitat en arròs (Oryza sativa), utilitzant enfocaments genètics, químics, moleculars i de biosensat. Per a obtenir perspectives comparatives, també s’han dut a terme estudis paral·lels amb Arabidopsis thaliana, model dicotiledoni àmpliament utilitzat juntament amb l’arròs com a model monocotiledoni en genòmica funcional.

Al Capítol 1, es va utilitzar el fosfit (Phi), un anàleg no metabolitzable del Pi, com a eina per estudiar la senyalització dependent del fosfat tant en arròs com en Arabidopsis. En condicions de suficient o alt contingut de Pi, el tractament amb Phi va millorar la resistència davant els fongs Magnaporthe oryzae (en arròs) i Plectosphaerella cucumerina (en Arabidopsis), revertint la susceptibilitat causada per l’excés de Pi en arròs i per la deficiència de Pi en Arabidopsis. L’anàlisi transcriptòmic en arròs va mostrar que Phi induïa gens de defensa, com els gens PR relacionats amb la patogènesi, el metabolisme secundari i les barreres estructurals. Phi també va alterar l’expressió de gens sensibles al Pi, com les proteïnes amb domini SPX i els factors de transcripció PHR, donant suport al seu paper com a modulador de la senyalització. Aquests resultats reforcen el valor del Phi com a agent bioestimulant, activador de defenses i eina per a l’estudi del fosfat. El Capítol 2 se centra en l’edició genètica de dos transportadors de Pi, OsPT1 i OsPT8, mitjançant la tècnica CRISPR-Cas9. OsPT1, expressat en condicions de Pi suficient, suprimeix les respostes immunitàries bàsiques. Les línies mutants presentaven una menor acumulació de Pi als brots i una major resistència a M. oryzae, amb un augment de l’expressió de OsPHO2 i OsPT8. Per contra, OsPT8, un transportador d’alta afinitat induït per la manca de Pi, també regulava negativament la immunitat però només en certs contextos nutricionals. Ambdós transportadors modulaven marcadors de defensa com OsPBZ1 i OsPR1a, recolzant un model on la disponibilitat de Pi i l’activitat dels transportadors configuren conjuntament el paisatge immunitari. Aquests resultats posicionen OsPT1 i OsPT8 com a mediadors clau de la balança entre creixement i defensa, i com a possibles dianes per a la millora varietal.

Al Capítol 3 es van utilitzar biosensors FLIPPi per visualitzar la dinàmica del Pi citosòlic en arrels vives d’arròs i Arabidopsis. Aquests sensors basats en FRET van revelar que els nivells de Pi fluctuen segons el subministrament extern, elicitors immunitaris, hormones i Phi. La manca de Pi va augmentar la relació FRET, indicant una reducció del Pi citosòlic, mentre que l’aplicació de Pi, hormones o elicitors de defensa la van reduir. La resolució espacial i temporal del sistema FLIPPi va confirmar que l’homeòstasi del Pi està estretament vinculada a l’activació immunitària, com també ho van confirmar les dades fisiològiques de Pi lliure.

En conjunt, aquesta tesi ofereix una anàlisi integral de com l’estat del fosfat regula el creixement i la resistència a malalties en plantes. Mitjançant el tractament químic, l’edició genètica i el biosensat en temps real, aquesta recerca aporta noves perspectives sobre el diàleg molecular entre nutrició i immunitat, i obre la porta a estratègies agrícoles més sostenibles que equilibrin productivitat i salut vegetal.

Las plantas enfrentan constantemente un equilibrio entre crecimiento y defensa, especialmente bajo condiciones ambientales variables y disponibilidad limitada de nutrientes. Entre los macronutrientes, el fósforo, absorbido principalmente como fosfato inorgánico (Pi), es esencial no solo para el desarrollo vegetal, sino también como regulador de las respuestas inmunitarias. Diversos estudios han demostrado que los desequilibrios nutricionales afectan la resistencia a enfermedades. Esta tesis investiga la relación entre la homeostasis del fosfato y la inmunidad en arroz (Oryza sativa), utilizando enfoques genéticos, químicos, moleculares y de biosensado. Para obtener perspectivas comparativas, también se realizaron estudios paralelos en Arabidopsis thaliana, modelo dicotiledóneo ampliamente usado junto al arroz como modelo monocotiledóneo en genómica funcional.

En el Capítulo 1, se utilizó el fosfito (Phi), un análogo no metabolizable del Pi, como herramienta para estudiar la señalización fosfato-dependiente en arroz y Arabidopsis. Bajo condiciones de Pi suficiente y alto, el tratamiento con Phi mejoró la resistencia frente a los hongos Magnaporthe oryzae (arroz) y Plectosphaerella cucumerina (Arabidopsis), revirtiendo la susceptibilidad causada por exceso de Pi en arroz y por deficiencia de Pi en Arabidopsis. El análisis transcriptómico en arroz mostró que Phi inducía genes de defensa como los relacionados con patogénesis (PR), el metabolismo secundario y barreras estructurales. Además, Phi alteró la expresión de genes sensibles al Pi, como los que codifican proteínas SPX y factores de transcripción PHR, apoyando su papel como modulador de señalización. Estos resultados destacan el valor de Phi como bioestimulante, agente de defensa y herramienta de investigación. El Capítulo 2 se centra en la edición genética de dos transportadores de Pi, OsPT1 y OsPT8, mediante CRISPR-Cas9. OsPT1, expresado bajo condiciones de Pi suficiente, suprime las respuestas inmunitarias basales. Las líneas mutantes mostraron menor acumulación de Pi en los brotes y mayor resistencia a M. oryzae, con aumento de OsPHO2 y OsPT8. Por su parte, OsPT8, inducido por deficiencia de Pi, también reguló negativamente la inmunidad, pero de forma dependiente del contexto nutricional. Ambos genes afectaron la expresión de marcadores de defensa como OsPBZ1 y OsPR1a, lo que sugiere que la disponibilidad de Pi y la actividad de los transportadores moldean la respuesta inmunitaria. Estos resultados posicionan a OsPT1 y OsPT8 como reguladores del equilibrio entre crecimiento y defensa y como posibles dianas para mejorar variedades más resistentes y eficientes en el uso de nutrientes.

En el Capítulo 3, se utilizaron biosensores FLIPPi para visualizar la dinámica del Pi citosólico en raíces vivas de arroz y Arabidopsis. Estos sensores basados en FRET mostraron que los niveles de Pi varían en respuesta al suministro externo, a hormonas de defensa, elicitores inmunitarios y Phi. La deficiencia de Pi elevó las razones FRET, mientras que la aplicación de Pi o elicitores redujo dichos valores. La alta resolución del sistema FLIPPi confirmó que la homeostasis de Pi está estrechamente vinculada a la activación inmunitaria, como también fue validado por datos fisiológicos de contenido libre de Pi.

En conjunto, esta tesis proporciona un análisis integral de cómo el estado del fosfato regula el crecimiento y la defensa en plantas. A través de tratamiento químico, edición génica y biosensado en tiempo real, se ofrecen nuevas perspectivas sobre la interacción entre nutrición e inmunidad, con aplicaciones potenciales en agricultura sostenible.

Plants constantly face a trade-off between growth and defense, especially under fluctuating environmental conditions and nutrient availability. Among macronutrients, phosphorus, absorbed primarily as inorganic phosphate (Pi), is crucial not only for plant development but also as a regulator of immune responses. Evidence in the literature also supports that nutrient imbalance has an effect on disease resistance. This thesis explores the intricate relationship between phosphate homeostasis and immunity in rice (Oryza sativa), employing a combination of genetic, chemical, molecular, and biosensing approaches. For comparative insights, parallel studies were also carried out in Arabidopsis thaliana, a model for dicotyledonous species, alongside rice, the monocotyledon model; both being reference models for functional genomics.

In Chapter 1, the non-metabolizable Pi analog phosphite (Phi) was used as a chemical tool to dissect Pi-related signaling in both rice and Arabidopsis thaliana. Under Pi-sufficient and high-Pi conditions, Phi treatment enhanced resistance to the fungal pathogens Magnaporthe oryzae (in rice) and Plectosphaerella cucumerina (in Arabidopsis), reversing the susceptibility conferred by Pi overaccumulation in rice and Pi deficiency in Arabidopsis. Transcriptomic analysis in rice revealed that Phi induced a broad defense program, including Pathogenesis-Related (PR) genes, secondary metabolism, and structural defense components. Phi also altered expression of Pi-responsive genes such as SPX-domain proteins and PHR transcription factors, supporting its role as a signaling modulator. These findings underscore Phi’s utility as both a biostimulant and plant defense priming agent, as well as a research tool for phosphate signaling studies.

Chapter 2 focuses on the genetic dissection of two Pi transporter genes, OsPT1 and OsPT8, using CRISPR-Cas9. OsPT1, constitutively expressed under Pi-sufficient conditions, was found to suppress basal immune responses. Mutant lines displayed reduced shoot Pi accumulation and enhanced resistance to M. oryzae, along with elevated expression of OsPHO2 and OsPT8, indicating compensatory regulation. Conversely, OsPT8, a high-affinity transporter induced under Pi-starvation, also negatively regulated immunity but only under specific Pi conditions. Both transporters modulated defense markers such as OsPBZ1 and OsPR1a, supporting a model where Pi availability and transporter activity together shape the immune landscape. These results highlight OsPT1 and OsPT8 as mediators of the growth-defense trade-off in rice and potential targets for breeding nutrient-efficient, disease-resistant varieties.

In Chapter 3, FLIPPi biosensors were employed to visualize cytosolic phosphate dynamics in live roots of rice and Arabidopsis. These FRET-based sensors revealed that Pi levels fluctuate in response to external Pi supply, immune elicitors, and Phi treatment. Pi-starvation led to elevated FRET ratios, consistent with reduced cytosolic Pi, while exogenous application of high Pi, defense-related hormones, and immunity elicitors reduced FRET ratios. The spatial and temporal resolution of FLIPPi imaging confirmed that Pi homeostasis is tightly coupled to immune activation, and validated by free Pi content data in physiological terms.

Together, this thesis provides a multi-level analysis of how phosphate status regulates growth and disease resistance in plants, rice and Arabidopsis. By integrating chemical treatment, gene editing, and real-time nutrient sensing, this investigation offers insights into the molecular logic of nutrient-defense crosstalk and lays the groundwork for more sustainable agricultural strategies that balance productivity and plant health.