NREM Alterations Accompany Dysregulation of Synaptic Proteome Dynamics in Syngap1 Heterozygous Mice

Abstract

Les alteracions del son són una característica molt comuna dels trastorns causats per mutacions en el gen SYNGAP1, encara que els mecanismes moleculars subjacents encara es desconeixen. En els últims anys, diversos estudis han demostrat una gran influència del son sobre el proteoma i fosfoproteoma sinàptics. Per aquest motiu, en aquest treball hem investigat com els estats de son/vigília i el ritme circadiari afecten el proteoma sinàptic en ratolins heterozigots per a Syngap1 (HET). Mitjançant anàlisis per immunoblot de preparacions enriquides en sinapsis corticals hem identificat una sèrie de canvis en el proteoma sinàptic, especialment en cinases i fosfatases implicades en la senyalització per calci, mediats tant pel son-vigília com pel ritme circadiari en ratolins WT. Aquests ratolins també presenten una reducció en proteïnes estructurals de la post-sinapsi i de receptors NMDA després d'una privació aguda de son. Contràriament, aquestes dinàmiques estan alterades en els ratolins HET, especialment en resposta a la privació de son, observant-se només una conservació parcial dels canvis mediats pel ritme circadiari. Aquesta desregulació probablement es deu a mecanismes post-transcripcionals, ja que els ratolins HET presenten una expressió conservada dels gens del rellotge circadiari i d'un grup de gens l'expressió dels quals esta controlada per l'activitat neuronal. D'altra banda, l’anàlisi del son mitjançant EEG mostra que la seva arquitectura global i la seva regulació circadiària està preservada en ratolins HET. No obstant, sí que hem trobat diferències subtils a en la microestructura del son, caracteritzades per episodis de son NREM més estables a causa d'una reducció en els microdespertars. A més, aquests ratolins presenten un augment del poder en les freqüències en el rang delta i una disminució del poder en les freqüències sigma durant el son NREM. L'augment de delta es deu a una major incidència, amplitud i durada de les ones lentes. Malgrat això, la seva regulació temporal deguda a la necessitat de dormir es troba preservada. D'altra banda, la reducció del poder sigma es deu a una marcada disminució en la densitat, durada i coherència dels fusos del son, acompanyada per una afectació en l'agrupació temporal d'aquests esdeveniments. En conjunt, les nostres dades assenyalen al son NREM com l'estat més afectat en els ratolins HET. Finalment, hem estudiat mitjançant espectrometria de masses els canvis diaris en el proteoma sinàptic. Mentre que el 10% d'aquest presenta una regulació rítmica en WTs, aproximadament la meitat d'aquests canvis es perden en HETs. A més, aquests animals presenten un conjunt de proteïnes cícliques que no es troben en els WTs, la qual cosa indica una reorganització patològica més que no pas una simple pèrdua dels ritmes moleculars normals. Cal destacar que la majoria de les proteïnes rítmiques conservades tenen el seu pic durant la fase de foscor, mentre que la majoria de les oscil·lacions perdudes o guanyades piquen durant la fase de llum, coincidint amb els períodes de major densitat de vigília i son NREM respectivament. En conjunt, aquestes troballes demostren que la deficiència de Syngap1 altera la interacció normal entre el son i l'homeòstasi del proteoma sinàptic, probablement a causa de les alteracions en la microestructura i oscil·lacions tàlem-corticals característiques del son NREM. Donat el paper crític de la funció sinàptica i el son en la consolidació de la memòria, aquestes alteracions podrien estar contribuint als dèficits cognitius i conductuals associats als trastorns causats per mutacions en SYNGAP1. Els nostres resultats suggereixen que estratègies terapèutiques orientades a restaurar les oscil·lacions característiques del son NREM podrien ser beneficioses per a mitigar les conseqüències de la deficiència de SYNGAP1.

Las alteraciones del sueño son una característica muy común de los trastornos causados por mutaciones en el gen SYNGAP1, aunque los mecanismos moleculares subyacentes aún se desconocen. En los últimos años, varios estudios han demostrado una gran influencia del sueño sobre el proteoma y fosfoproteoma sináptico. Por este motivo, en este trabajo hemos investigado como los estados de sueño/vigilia y el ritmo circadiano afectan al proteoma sináptico en ratones heterocigotos para Syngap1 (HET). Mediante análisis por inmunoblot de preparaciones enriquecidas en sinapsis corticales, hemos identificado una serie de cambios en el proteoma sináptico, especialmente en quinasas y fosfatasas implicadas en la señalización por calcio, mediados tanto por el sueño-vigilia como por el ritmo circadiano en ratones WT. Estos ratones también presentan una reducción en proteínas estructurales de la post-sinapsis y de receptores NMDA tras una privación aguda de sueño. En contraste, estas dinámicas están alteradas en los ratones HET, especialmente en respuesta a la privación de sueño, observándose solo una conservación parcial de los cambios mediados por el ritmo circadiano. Esta desregulación probablemente se debe a mecanismos post-transcripcionales, ya que los ratones HET presenta una expresión génica conservada de los genes del reloj circadiano y de un grupo de genes cuya expresión esta controlada por la actividad neuronal. Por otro lado, nuestro análisis del sueño mediante EEG muestra que la arquitectura global del sueño y su regulación circadiana en ratones HET está preservada. Sin embargo, sí que hemos encontrado diferencias sutiles a en la microestructura del sueño, caracterizadas por episodios de sueño NREM más estables debido a una reducción en los microdespertares. Además, estos ratones presentan un aumento del poder en las frecuencias en el rango delta y una disminución del poder en las frecuencias sigma durante el sueño NREM. El aumento de delta se debe a una mayor incidencia, amplitud y duración de las ondas lentas. A pesar de esto, su regulación temporal debida a la necesidad de dormir se encuentra preservada. Por otro lado, la reducción del poder sigma se debe a una marcada disminución en la densidad, duración y coherencia de los husos del sueño, acompañada por una afectación en la agrupación temporal de estos eventos. En conjunto, nuestros datos señalan al sueño NREM como el estado más afectado en los ratones HET. Por último, hemos estudiado mediante espectrometría de masas los cambios diarios en el proteoma sináptico. Mientras que el 10% de este presenta una regulación rítmica en WTs, aproximadamente la mitad de estos cambios se pierden en HETs. Además, estos animales presentan un conjunto de proteínas cíclicas que no está presente en los WTs, lo que indica una reorganización patológica más que una simple pérdida de los ritmos moleculares normales. Cabe destacar que la mayoría de las proteínas rítmicas conservadas tienen su pico durante la fase de oscuridad, mientras que la mayoría de las oscilaciones perdidas o ganadas pican durante la fase de luz, coincidiendo con los periodos de mayor densidad de vigilia y sueño NREM respectivamente. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la deficiencia de Syngap1 altera la interacción normal entre el sueño y la homeostasis del proteoma sináptico, probablemente debido a las alteraciones en la microestructura y oscilaciones tálamo-corticales características del sueño NREM. Dado el papel crítico de la función sináptica y el sueño en la consolidación de la memoria, estas alteraciones podrían estar contribuyendo en algunos de los déficits cognitivos y conductuales asociados a los trastornos causados por mutaciones en SYNGAP1. Nuestros resultados sugieren que estrategias terapéuticas orientadas a restaurar las oscilaciones características del sueño NREM podrían ser beneficiosas para mitigar las consecuencias de la deficiencia de SYNGAP1.

Sleep disturbances are a prominent feature of SYNGAP1-related disorders, yet the molecular mechanisms underlying them remain unclear. In recent years, a few studies have shown the extensive impact of sleep on the synaptic proteome and phosphoproteome. Here, we investigated the regulation of the synaptic proteome across sleep-wake states and circadian rhythms in Syngap1 heterozygous (HET) mice. Using immunoblot analysis of purified cortical synapses, we found that wild-type (WT) mice exhibit robust state- and circadian-dependent modulation of key synaptic proteins, particularly kinases and phosphatases involved in calcium signalling, along with a downregulation of core scaffolding PSD proteins and NMDA receptors after acute sleep deprivation. In contrast, these dynamics are lost in HET mice, especially in response to sleep deprivation, with only a partial preservation of circadian influences. This dysregulation likely stems from post-transcriptional mechanisms rather than upstream transcriptional defects since transcriptomic profiling demonstrated that rhythmic expression of core clock genes and activity-dependent genes remained intact in the HETs. EEG analyses revealed that global sleep architecture was preserved in HET mice, with similar total sleep time and maintained circadian regulation of sleep-wake patterns. However, subtle differences emerged at the level of sleep microarchitecture, characterized by more stable NREM bouts due to a reduction in microarousals. Additionally, HET mice showed increased delta and decreased sigma power during NREM sleep. The delta increase resulted from elevated incidence, amplitude, and duration of slow waves, although their regulation by sleep pressure was preserved. The reduction in sigma power was due to a striking decrease in spindle density, duration, and coherence. Moreover, we found impaired clustering at the infraslow timescale of spindles in HETs. Taken together, this data points to NREM sleep as the most affected state in HET mice. Mass spectrometry analysis revealed extensive remodelling of the synaptic cycling proteome in Syngap1 deficiency. While 10% of the WT synaptic proteome exhibited rhythmic regulation, approximately half of these changes were lost in HET mice. Interestingly, a new set of cyclic proteins was found in HETs, indicating a pathological reorganization rather than a simple loss of these molecular rhythms. Notably, most preserved rhythmic proteins peaked during the dark phase, whereas most lost and gained oscillations occurred during the light phase, coinciding with the periods of highest wakefulness and NREM density, respectively. Together, these findings demonstrate that Syngap1 heterozygosity disrupts the normal interplay between sleep and synaptic proteome homeostasis. Deficits in NREM sleep microarchitecture and alterations in thalamocortical oscillations likely contribute to synaptic dysregulation. Given the critical roles of synaptic function and sleep in memory consolidation, these disturbances may underlie some of the cognitive and behavioural impairments associated with SYNGAP1-related disorders. Our results suggest that therapeutic strategies aimed at restoring oscillations characteristic of NREM sleep would be beneficial in mitigating the consequences of SYNGAP1 heterozygosity.