Desenvolupament i integració de sensors de llarga vida en sistemes lab-on-a-chip per al monitoratge de cultius cel·lulars

Abstract

El desenvolupament de sistemes de monitorització contínua i de llarg termini per a cultius cel·lulars representa un desafiament clau en el camp de la biologia. Malgrat els avenços en biosensors, la seva aplicació directa en entorns complexos com els medis de cultiu cel·lular sovint es veu limitada per problemes com el biofouling, la deriva del senyal i la curta vida útil dels sensors. Aquesta tesi doctoral té com a objectiu principal desenvolupar sensors electroquímics i fotònics robustos i integrables, capaços de monitorar paràmetres químics i metabòlics rellevants en cultius cel·lulars, superant les limitacions actuals dels dispositius comercials. Per assolir-ho, es proposa l’ús de fibroïna de seda com a material funcional per millorar la biocompatibilitat, estabilitat i resistència al biofouling dels sensors electroquímics. En primer lloc, es va explorar un sensor òptic per al seguiment de la diferenciació cel·lular en temps real. Es van utilitzar guies òptiques cel·lulars per detectar tant la dispersió de la llum com l’absorció. Aquest sistema es va aplicar amb èxit al monitoratge de la diferenciació d’adipòcits 3T3-L1, mostrant capacitat per detectar canvis en la morfologia cel·lular i en l’acumulació lipídica. Aquest sensor ofereix una via no invasiva i contínua per al seguiment de cultius cel·lulars. En segon lloc, es van modificar sensors potenciomètrics tipus ISFET per a la detecció de pH, als quals s’hi va aplicar una capa de fibroïna cristal·litzada. Aquests sensors es van caracteritzar electroquímicament i es van validar en cultius cel·lulars de Neuro-2a, HEK-293T i cèl·lules renals. Els resultats mostren una millora substancial en estabilitat i reproductibilitat, amb una durabilitat que va passar de 8 a 70 hores sense recalibratge, i una correlació molt alta (índex de Willmott de fins a 0.97). Aquest avanç permet mesurar l’acidificació del medi i estudiar processos com la resposta a fàrmacs de forma fiable. En tercer lloc, es va desenvolupar un sensor amperimètric enzimàtic per a la detecció de glucosa, utilitzant glucosa oxidasa (GOx) i el mediador TMB, tots dos encapsulats en una matriu de fibroïna. Aquest sensor es va integrar en un sistema microfluídic per a la seva aplicació directa en cultius cel·lulars. Es va demostrar una alta sensibilitat, un límit de detecció baix i una operativitat prolongada durant més de 90 hores. El sensor va ser capaç de detectar dinàmicament canvis en el consum de glucosa i la resposta a inhibidors metabòlics en cultius de Neuro-2a, mostrant una elevada correlació amb mètodes comercials. A més dels tres sensors principals, es va dur a terme el disseny i la caracterització de matrius de microelèctrodes (MEA) per a la detecció d’activitat elèctrica cel·lular, així com el desenvolupament exploratori de sensors ChemFET amb fibroïna per a la mesura de clorurs. Tot i que aquests desenvolupaments no van assolir el grau de maduresa dels sensors principals, aporten una base per a futures línies d’investigació. En conjunt, aquesta tesi demostra que la integració de sensors potenciomètrics, amperomètrics i òptics funcionalitzats amb fibroïna és una estratègia efectiva per superar les limitacions tradicionals dels sensors en entorns de cultiu cel·lular. Els resultats obtinguts mostren que aquests sensors són capaços d’oferir una resposta fiable, estable i biocompatible durant períodes prolongats, contribuint així a la creació de sistemes Lab-on-a-Chip més autònoms i precisos. Aquests avenços obren la porta a noves aplicacions en recerca biomèdica, farmacologia i producció biotecnològica de cèl·lules i teixits.

El desarrollo de sistemas de monitorización continua y de largo plazo para cultivos celulares supone un desafío clave en el campo de la biología. A pesar de los avances en biosensores, su aplicación directa en entornos complejos como los medios de cultivo celular se ve a menudo limitada por problemas como el biofouling, la deriva de la señal y la corta vida útil de los sensores. Esta tesis doctoral tiene como objetivo principal desarrollar sensores electroquímicos y fotónicos robustos e integrables, capaces de monitorizar parámetros químicos y metabólicos relevantes en cultivos celulares, superando las actuales limitaciones de los dispositivos comerciales. Para ello, se propone el uso de fibroína de seda en dos de los sensores como material funcional para mejorar la biocompatibilidad, estabilidad y resistencia al biofouling de los sensores electroquímicos. En primer lugar, se exploró un sensor óptico para el seguimiento de la diferenciación celular en tiempo real. Se utilizaron guías ópticas celulares para detectar tanto la dispersión de la luz como la absorción. Este sistema se aplicó con éxito en la monitorización de la diferenciación de adipocitos 3T3-L1, mostrando capacidad para detectar cambios en la morfología celular y en la acumulación lipídica. Este sensor ofrece una vía no invasiva y continua para el seguimiento de cultivos celulares. En segundo lugar, se modificaron sensores potenciométricos tipo ISFET para la detección de pH, a los que se aplicó una capa de fibroína cristalizada. Estos sensores se caracterizaron electroquímicamente y se validaron en cultivos celulares de Neuro-2a, HEK-293T y células renales. Los resultados muestran una mejora sustancial en estabilidad y reproducibilidad, con una durabilidad que pasó de 8 a 70 horas sin recalibrado, y una correlación muy alta (índice de Willmott de hasta 0.97). Este avance permite medir la acidificación del medio y estudiar procesos como la respuesta a fármacos de forma fiable. En tercer lugar, se desarrolló un sensor amperimétrico enzimático para la detección de glucosa, utilizando glucosa oxidasa (GOx) y el mediador TMB, ambos encapsulados en una matriz de fibroína. Este sensor se integró en un sistema microfluídico para su aplicación directa en cultivos celulares. Se demostró una alta sensibilidad, un límite de detección bajo y una prolongada operatividad durante más de 90 horas. El sensor fue capaz de detectar dinámicamente cambios en el consumo de glucosa y la respuesta a inhibidores metabólicos en cultivos de Neuro-2a, mostrando una elevada correlación con métodos comerciales. Además de los tres sensores principales, se llevó a cabo el diseño y caracterización de matrices de microelectrodos (MEA) para la detección de actividad eléctrica celular, así como el desarrollo exploratorio de sensores ChemFET con fibroína para la medida de cloruros. Aunque estos desarrollos no alcanzaron el grado de madurez de los principales sensores, aportan una base para futuras líneas de investigación. En conjunto, esta tesis demuestra que la integración de sensores potenciométricos, amperométricos y ópticos funcionalizados con fibroína es una estrategia efectiva para superar las limitaciones tradicionales de los sensores en entornos de cultivo celular. Los resultados obtenidos muestran que estos sensores son capaces de ofrecer una respuesta fiable, estable y biocompatible durante períodos prolongados, contribuyendo así a la creación de sistemas Lab-on-a-Chip más autónomos y precisos. Estos avances abren la puerta a nuevas aplicaciones en investigación biomédica, farmacología y producción biotecnológica de células y tejidos.

The development of continuous and long-term monitoring systems for cell cultures represents a key challenge in biology. Despite significant advances in biosensor technologies, their direct application in complex environments such as cell culture media is often hindered by issues including biofouling, signal drift, and limited operational lifespan. The primary objective of this doctoral thesis is the development of robust and integrable electrochemical and photonic sensors capable of monitoring key chemical and metabolic parameters in cell cultures, while overcoming the limitations of existing commercial devices. To achieve this, silk fibroin is proposed as a functional material to enhance the biocompatibility, stability, and resistance to biofouling of electrochemical sensors. First, an optical sensor for real-time monitoring of cell differentiation was explored. Modified optical fibers were employed to detect both light scattering and absorbance. This system was successfully applied to monitor the differentiation of 3T3-L1 adipocytes, demonstrating the ability to detect changes in cell morphology and lipid accumulation. This sensor offers a non-invasive and continuous method for phenotypic monitoring of differentiated cell cultures. Second, potentiometric ISFET sensors for pH detection were modified by applying a crystallized silk fibroin coating. These sensors were electrochemically characterized and validated in Neuro-2a, HEK-293T, and renal cell cultures. The results showed a substantial improvement in stability and reproducibility, with operational lifetime extended from 8 to 70 hours without recalibration, and a very high correlation with standard methods (Willmott index up to 0.97). This represents a significant advance in reliably measuring medium acidification and drug response in cell cultures.

Third, an enzymatic amperometric sensor was developed for glucose detection using glucose oxidase (GOx) and TMB as mediator, both encapsulated in a silk fibroin matrix. This sensor was integrated into a microfluidic platform for direct application in cell culture. It demonstrated high sensitivity, a low detection limit, and stable performance over more than 90 hours. The sensor effectively captured dynamic changes in glucose consumption and metabolic responses in Neuro-2a cultures, showing strong correlation with commercial methods. In addition to the three core sensors, the thesis includes the design and characterization of microelectrode arrays (MEAs) for the detection of cellular electrical activity, as well as an exploratory development of silk fibroin-based ChemFETs for chloride detection. Although these developments did not reach the maturity of the main sensors, they provide a foundation for future research into bioelectrical and selective electrochemical monitoring. Overall, this thesis demonstrates that the integration of silk fibroin-functionalized potentiometric, amperometric, and optical sensors is an effective strategy to overcome traditional limitations of sensors in cell culture environments. The results show that these sensors can provide reliable, stable, and biocompatible responses over extended periods, contributing to the development of more autonomous and precise Lab-on-a-Chip systems. These advances pave the way for new applications in biomedical research, pharmacology, and the biotechnological production of cells and tissues.