Precision tolerance: antigen-specific phosphatidylserine-liposome based platform for autoimmune diseases

Abstract

La pèrdua de la tolerància immunològica és un factor clau en el desenvolupament de les malalties autoimmunes, la prevalença de les quals continua en augment i afecta actualment al 5–10 % de la població mundial. Les estratègies terapèutiques convencionals se centren en l'alleujament simptomàtic, teràpies substitutives o la immunosupressió d'ampli espectre. No obstant això, aquests enfocaments no aborden la disfunció immunològica subjacent i s'associen a greus efectes adversos. A pesar que els recents avanços han donat lloc a estratègies prometedores, persisteix una necessitat de desenvolupar teràpies segures i específiques enfront d'autoantígens capaços de restablir una tolerància immunològica duradora. Aquest treball explora una plataforma inmunoterapèutica basada en la biomimètica del mecanisme d'eliminació de cèl·lules apoptòtiques. Es van dissenyar liposomes enriquits en fosfatidilserina (PS) que encapsulen autoantígens rellevants per a la malaltia, amb l'objectiu d'induir tolerància específica enfront de l'antigen i restablir l'homeòstasi immunològica. Estudis previs han demostrat l'adaptabilitat d'aquest enfocament a diferents respostes autoimmunitàries, contribuint a la reinducció de la tolerància en models murins de diabetis tipus 1 (T1D) i esclerosi múltiple. A més, cèl·lules dendrítiques (DCs) derivades de pacients amb T1D van mostrar un fenotip tolerogènic i una modulació funcional després del tractament. La hipòtesi d'aquest treball és que la immunoteràpia basada en PS-liposomes pot restablir de manera segura i eficaç la tolerància específica enfront d'antígens en diverses malalties autoimmunitàries, mitjançant la inducció d'un perfil tolerogènic en les cèl·lules immunitàries. L'objectiu principal va ser aprofundir en la comprensió del mecanisme d'acció d'aquesta immunoteràpia, amb la finalitat de dissenyar l'enfocament més adequat que garanteixi la seva eficàcia i seguretat. Per a això, es van encapsular amb èxit diferents autoantígens en els PS-liposomes. Els estudis de biodistribució realitzats en models murins, van identificar la via intravenosa (i.v.) com la més rellevant des del punt de vista clínic, per la seva ràpida distribució sistèmica i la seva acumulació específica en òrgans immunològicament rellevants. Amb la finalitat de demostrar una modulació antigen-específica, es van tractar ratolins transgènics BDC2.5mi amb PS-liposomes encapsulant el pèptid 2.5mi. Als quatre dies de tractament, es va observar una expansió significativa de cèl·lules T reguladores convencionals i no convencionals específiques de l'antigen, així com de subconjunts de cèl·lules B reguladores. Per a avaluar la rellevància translacional, es van utilitzar cèl·lules mononuclears de sang perifèrica de pacients amb Miastènia greu i Artritis Reumatoide per a diferenciar monòcits en cèl·lules dendrítiques. Així mateix, es van aïllar i van diferenciar monòcits del líquid sinovial. Aquestes DCs humanes van internalitzar eficaçment els PS-liposomes i, després de la seva captació, van adquirir un fenotip tolerogènic. Així mateix, la captació de liposomes i el seu processament va conduir a la presentació d'antigen encapsulat a través de molècules del MHC de classe II. En coherència amb això, les DCs toleritzades van mostrar una funcionalitat tolerogènica específica de l'antigen, inhibint la proliferació autòloga de limfòcits T CD4⁺ i CD8⁺. D'altra banda, cèl·lules B humanes també van demostrar la capacitat d'internalitzar PS-liposomes fluorescents. Després de la captació, aquestes cèl·lules van produir majors nivells de les citocines antiinflamatòries IL-10 i TGF-β en comparació amb les cèl·lules B incapaces d'interactuar. Finalment, per a abordar la seguretat de l'administració i.v. en humans, es van realitzar assajos de hemocompatibilitat i anàlisis de citocines associades a la síndrome d'alliberament de citocines, obtenint-se resultats favorables. A més, es va desenvolupar un assaig de potència robust i reproduïble capaç d'avaluar l'activitat biològica de cada lot de PS-liposomes. En conjunt, aquests resultats recolzen la viabilitat clínica de la plataforma, destacant la seva capacitat per a induir tolerància específica enfront d'antígens, modular respostes immunitàries tant en models murins com en humans, i mantenir un perfil de seguretat favorable.

La pérdida de la tolerancia inmunológica es un factor clave en el desarrollo de las enfermedades autoinmunes, cuya prevalencia continúa en aumento y afecta actualmente al 5–10 % de la población mundial. Las estrategias terapéuticas convencionales se centran en el alivio sintomático, terapias sustitutivas o la inmunosupresión de amplio espectro. Sin embargo, estos enfoques no abordan la disfunción inmunológica subyacente y se asocian a graves efectos adversos. A pesar de que los recientes avances han dado lugar a estrategias prometedoras, persiste una necesidad de desarrollar terapias seguras y específicas frente a autoantígenos capaces de restablecer una tolerancia inmunológica duradera. Este trabajo explora una plataforma inmunoterapéutica basada en la biomimética del mecanismo de eliminación de células apoptóticas. Se diseñaron liposomas enriquecidos en fosfatidilserina (PS) que encapsulan autoantígenos relevantes para la enfermedad, con el objetivo de inducir tolerancia específica frente al antígeno y restablecer la homeostasis inmunológica. Estudios previos han demostrado la adaptabilidad de este enfoque a distintas respuestas autoinmunitarias, contribuyendo a la reinducción de la tolerancia en modelos murinos de diabetes tipo 1 (T1D) y esclerosis múltiple (EM). Además, células dendríticas (DCs) derivadas de pacientes con T1D mostraron un fenotipo tolerogénico y una modulación funcional tras el tratamiento. La hipótesis de este trabajo es que la inmunoterapia basada en PS-liposomas puede restablecer de manera segura y eficaz la tolerancia específica frente a antígenos en diversas enfermedades autoinmunitarias, mediante la inducción de un perfil tolerogénico en las células inmunitarias. El objetivo principal fue profundizar en la comprensión del mecanismo de acción de esta inmunoterapia, con el fin de diseñar el enfoque más adecuado que garantice su eficacia y seguridad. Para ello, se encapsularon con éxito diferentes autoantígenos en los PS-liposomas. Los estudios de biodistribución realizados en modelos murinos, identificaron la vía intravenosa (i.v.) como la más relevante desde el punto de vista clínico, por su rápida distribución sistémica y su acumulación específica en órganos inmunológicamente relevantes. Con el fin de demostrar una modulación antígeno-específica, se trataron ratones transgénicos BDC2.5mi con PS-liposomas encapsulando el péptido 2.5mi. A los cuatro días de tratamiento, se observó una expansión significativa de células T reguladoras convencionales y no convencionales específicas del antígeno, así como de subconjuntos de células B reguladoras. Para evaluar la relevancia traslacional, se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes con Miastenia Gravis (MG) y Artritis Reumatoide (AR) para diferenciar monocitos en células dendríticas. Asimismo, se aislaron y diferenciaron monocitos del líquido sinovial. Estas DCs humanas internalizaron eficazmente los PS-liposomas y, tras su captación, adquirieron un fenotipo tolerogénico. Así mismo, la captación de liposomas y su procesamiento condujo a la presentación de antígeno encapsulado a través de moléculas del MHC de clase II. En coherencia con ello, las DCs tolerizadas mostraron una funcionalidad tolerogénica específica del antígeno, inhibiendo la proliferación autóloga de linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺. Por otro lado, células B humanas también demostraron la capacidad de internalizar PS-liposomas marcados fluorescentemente. Tras la captación, estas células produjeron mayores niveles de las citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-β en comparación con las células B incapaces de interactuar. Finalmente, para abordar la seguridad de la administración i.v. en humanos, se realizaron ensayos de hemocompatibilidad y análisis de citoquinas asociadas al síndrome de liberación de citoquinas, obteniéndose resultados favorables. Además, se desarrolló un ensayo de potencia robusto y reproducible capaz de evaluar la actividad biológica de cada lote de PS-liposomas. En conjunto, estos resultados respaldan la viabilidad clínica de la plataforma, destacando su capacidad para inducir tolerancia específica frente a antígenos, modular respuestas inmunitarias tanto en modelos murinos como en humanos, y mantener un perfil de seguridad favorable.

The breakdown of the immune tolerance drives the development of autoimmune diseases, the prevalence of which is steadily rising and currently affects an estimated 5–10% of the global population. Conventional therapeutic strategies predominantly focus on symptomatic relief, replacement therapies, or broad-spectrum immunosuppression. These approaches fail to address the underlying immunological dysregulation and are often associated with significant adverse effects. While recent advances in immunotherapy have yielded promising strategies to modulate autoimmune responses, a critical need remains for safe antigen-specific approaches capable of restoring long-lasting immune tolerance. This doctoral work explores an innovative immunotherapeutic platform based on the biomimicry of apoptotic cell clearance mechanism. Specifically, phosphatidylserine (PS)-enriched liposomes encapsulating disease-relevant autoantigens were engineered to induce antigen-specific immune tolerance and restore homeostasis in autoimmune settings. Previous studies have demonstrated the adaptability of this approach to different autoimmune responses contributing to the safe long-tern re-establishment of tolerance in the T1D and MS murine models. Furthermore, human dendritic cells (DCs) derived from T1D patients exhibited a tolerogenic phenotype and functional modulation following uptake of insulin-loaded PS-liposomes. The central hypothesis of this work is that PS-liposome-based immunotherapy can safely and effectively restore antigen-specific tolerance in several antigen-driven autoimmune disorders by modulating interacting immune cells toward a tolerogenic state. The main objective was to gain an in-depth understanding of how the immunotherapy works to design the best approach to ensure efficacy and safety in the future clinical trial. To this end, different autoantigens were successfully encapsulated within PS-liposomes. Biodistribution studies in murine models using various administration routes identified intravenous (i.v.) delivery as the most clinically relevant, owing to its rapid systemic distribution and targeted accumulation in immunologically significant organs such as the liver and spleen, where professional phagocytes efficiently internalized the liposomes. To demonstrate antigen-specific immune modulation, transgenic BDC2.5mi mice were treated with PS-liposomes encapsulating the 2.5mi peptide. After four days, there was a notable expansion of antigen-specific conventional and non-conventional regulatory T cells, as well as regulatory B cell subsets. By day thirteen, the therapy also induced antigen-specific exhausted and anergic T cells, suggesting its potential to promote long-term immune tolerance. To assess translational relevance, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with Myasthenia Gravis (MG) and Rheumatoid Arthritis (RA) were used to differentiate monocytes into DCs. Additionally, putative monocytes from the synovial fluid were also isolated and differentiated. These human DCs effectively internalized PS-liposomes and, upon uptake, exhibited a tolerogenic phenotype characterized by upregulation of PS receptors, HLA-DR, chemokine receptors, and key tolerogenic markers such as DC-SIGN and PD-L1, alongside a downregulation of costimulatory molecules such as CD86 and CD54. Notably, PS-liposome uptake also led to antigen processing and presentation via MHC class II molecules. In line with this, tolerised DCs presented antigen-specific tolerogenic functionality impairing the autologous CD4+ and CD8+ T cell. Moreover, human B cells also demonstrated the ability to internalize fluorescently labelled PS-liposomes. These cells subsequently produced elevated levels of the anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β compared to non-interacting B cells, further supporting the tolerogenic potential of the platform. Finally, to address the safety of the i.v. administration into humans, hemocompatibility assays and cytokine release syndrome (CRS)-associated cytokine profiling were performed yielding favourable safety outcomes. Additionally, a robust and reproducible potency assay was developed to evaluate the biological activity of each PS-liposome batch, providing a critical quality control tool for translational development. Collectively, these findings support the clinical translation of PS-liposome platform, highlighting its capacity to induce antigen-specific tolerance, modulate immune responses in both murine and human systems, and maintain a favourable safety profile.