Deciphering the role of the neuroimmune response in a mouse model of mitochondrial disease

Abstract

Els mitocondris són essencials per al manteniment de l'homeòstasi cel·lular, i la seva funció és especialment crítica al sistema nerviós central. Les mutacions genètiques que afecten la funció mitocondrial causen malalties mitocondrials primàries (MM), un grup de trastorns rars però fatals que sovint afecten el cervell i que actualment no tenen cura. La Síndrome de Leigh (SL) és la MM pediàtrica més comuna i l'encefalopatia mitocondrial més freqüent en infants. La SL està freqüentment associada a una deficiència del complex I (CI). Dins d’aquest context, les mutacions al gen NDUFS4, una subunitat del CI, són una causa important de la SL. El ratolí knockout per Ndufs4 (Ndufs4KO) és un model animal àmpliament utilitzat per estudiar la patologia de la SL, ja que recapitula les principals característiques de la malaltia humana: neurodegeneració en àrees específiques com el bulb olfactori (BO), els nuclis vestibulars i el cerebel, alteracions motores i respiratòries i una esperança de vida reduïda. Aquesta afectació regional i cel·lular específica, però, encara no està del tot explicada. El model Ndufs4KO es caracteritza per la presència de gliosi progressiva en les àrees afectades. Estudis recents han posat de manifest el paper actiu de la micròglia en la neurodegeneració observada en aquest model. La seva depleció, així com la dels macròfags perifèrics, s’ha associat amb una millora clínica remarcable, cosa que indica que la resposta neuroimmune és un factor central en la patogènesi. En els darrers anys, s’ha proposat que els mitocondris són clau en la regulació de resposta immune. En el context de disfunció mitocondrial, els àcids nucleics mitocondrials poden alliberar-se al citosol, on són detectats per receptors immunes. Això condueix a l’activació de vies antivirals, incloent-hi respostes d’interferó de tipus I (IFN-I). L'activació aberrant d’aquestes vies s'ha relacionat amb malalties neurodegeneratives i, més recentment, amb les MM. En aquesta línia, el nostre grup d’investigació va identificar un increment de l’expressió de gens antivirals en neurones GABAèrgiques deficients en Ndufs4 al BO. En aquesta tesi, hem demostrat que la deleció de Ndufs4 indueix l’expressió de gens antivirals en regions cerebrals afectades. També hem demostrat que la deleció del gen Ifnar1, que codifica per una subunitat del receptor d’IFN-I, atenua parcialment aquesta resposta i modula la reactivitat microglial, però no modifica la progressió de la malaltia, suggerint que la senyalització de IFN-I no és un factor clau en la patologia. A més, hem identificat que el sensor citosòlic d’ARN de doble cadena Protein Kinase R (PKR) contribueix a la malaltia. La inhibició de PKR allarga significativament la supervivència i redueix la microgliosi en el ratolí Ndufs4KO. També hem determinat que PKR participa en la patologia mitjançant vies proinflamatòries, i que el seu efecte perjudicial és independent de la inhibició de la síntesi proteica. Altrament, també hem estudiat la resposta neuroimmune mitjançant RNA-Seq de cèl·lules CD11b+ en diversos models. El perfil d’expressió gènica de les cèl·lules mieloides en els ratolins Ndufs4KO mostra que la senyalització antiviral es produeix no només en neurones, sinó també en cèl·lules CD11b+. A més, hem identificat que la senyalització antiviral a cèl·lules mieloides depèn de IFN-I, però que el increment de PKR en altres tipus de cèl·lules és parcialment independent de IFN-I. Proposem que la disfunció mitocondrial en neurones inicia una resposta antiviral que és posteriorment propagada i amplificada per les cèl·lules del sistema immune. Per últim, hem explorat l’impacte de la deficiència intrínseca de Ndufs4 en la micròglia mitjançant RNA-Seq de cèl·lules CD11b+ en ratolins amb deficiència de Ndufs4 només en neurones. En conjunt, en aquesta tesi hem identificat una resposta antiviral induïda per disfunció mitocondrial que constitueix esdeveniment patogènic rellevant en les MM, que potser explorat com a diana terapèutica.

Las mitocondrias son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular, y su función es especialmente crítica en el sistema nervioso central. Las mutaciones genéticas que afectan la función mitocondrial causan enfermedades mitocondriales primarias (EM), un grupo de trastornos poco frecuentes pero letales que a menudo afectan al cerebro y que actualmente no tienen cura. El síndrome de Leigh (SL) es la EM pediátrica más común y la encefalopatía mitocondrial más frecuente en niños. El SL suele asociarse a una deficiencia del complejo I (CI). En este contexto, las mutaciones en el gen NDUFS4, que codifica una subunidad del CI, constituyen una causa importante de SL. El ratón knockout para Ndufs4 (Ndufs4KO) es un modelo animal ampliamente utilizado, ya que reproduce las principales características del SL en humanos neurodegeneración en áreas específicas como el bulbo olfatorio (BO), los núcleos vestibulares y el cerebelo, alteraciones motoras y respiratorias, y una esperanza de vida reducida. Sin embargo, esta afectación específica a nivel regional y celular aún no se comprende completamente. El modelo Ndufs4KO se caracteriza por la presencia de gliosis progresiva en las áreas afectadas. Estudios recientes han puesto de manifiesto el papel activo de la microglía en la neurodegeneración observada en este modelo. Su eliminación, así como la de los macrófagos periféricos, se ha asociado con una mejora clínica significativa, lo que indica que la respuesta neuroinmune es un factor central en la patogénesis. En los últimos años, se ha propuesto que las mitocondrias desempeñan un papel clave en la regulación de la respuesta inmune. En el contexto de disfunción mitocondrial, los ácidos nucleicos mitocondriales pueden liberarse al citosol, donde son detectados por receptores inmunes. Esto conduce a la activación de vías antivirales, incluyendo respuestas mediadas por interferón tipo I (IFN-I). La activación aberrante de estas vías se ha relacionado con enfermedades neurodegenerativas y, más recientemente, con las EM. En esta línea, nuestro grupo de investigación identificó un aumento en la expresión de genes antivirales en neuronas GABAérgicas deficientes en Ndufs4 en el BO. En esta tesis hemos demostrado que la deleción de Ndufs4 induce la expresión de genes antivirales en regiones cerebrales afectadas. También hemos mostrado que la eliminación del gen Ifnar1, que codifica una subunidad del receptor de IFN-I, atenúa parcialmente esta respuesta y modula la reactividad microglial, pero no modifica la progresión de la enfermedad, sugiriendo que la señalización de IFN-I no es un factor clave en la patología. Además, hemos identificado que el sensor citosólico de ARN de doble cadena Protein Kinase R (PKR) contribuye al desarrollo de la enfermedad. La inhibición de PKR prolonga significativamente la supervivencia y reduce la microgliosis en el ratón Ndufs4KO. También hemos determinado que PKR participa en la patología mediante vías proinflamatorias, y no mediante la inhibición de la síntesis proteica. Paralelamente, también hemos estudiado la respuesta neuroinmune mediante RNA-Seq de células CD11b+ en varios modelos. El perfil de expresión génica de las células mieloides Ndufs4KO muestra que la señalización antiviral ocurre también en células CD11b+. Además, hemos identificado que la señalización antiviral en células mieloides depende de IFN-I, mientras que el aumento de PKR en otros tipos celulares es parcialmente independiente de IFN-I. Proponemos que la disfunción mitocondrial en neuronas inicia una respuesta antiviral que posteriormente es propagada y amplificada por las células inmunes. Por último, hemos explorado el impacto de la deficiencia intrínseca de Ndufs4 en la microglía mediante RNA-Seq de células CD11b+ en ratones con deleción de Ndufs4 solo en neuronas. En conjunto, la presente tesis identifica una respuesta antiviral inducida por disfunción mitocondrial que constituye un evento patogénico relevante en las EM y que podría explorarse como diana terapéutica.

Mitochondria are essential for maintaining cellular homeostasis, and their function is particularly critical in the central nervous system. Genetic mutations that impair mitochondrial function cause primary mitochondrial diseases (MDs), a group of untreatable, rare, and fatal disorders that often present with early-onset neurodegeneration. Leigh Syndrome (LS) is the most common pediatric mitochondrial disorder and the most prevalent mitochondrial encephalopathy in children, frequently associated with complex I (CI) deficiency. Among CI-related mutations, loss-of-function variants in the NDUFS4 gene are a leading cause of autosomal recessive LS. The Ndufs4 knockout (Ndufs4KO) mouse model faithfully recapitulates major features of the human disease, including region-specific neurodegeneration, motor and respiratory alterations, and early death. Pathology in this model exhibits marked regional and cell-type specificity, particularly affecting the vestibular nuclei, olfactory bulb (OB), and cerebellum. However, the mechanisms underlying this selective vulnerability remain incompletely understood. Progressive gliosis in affected regions is a hallmark of Ndufs4KO pathology and correlates with disease severity. Recent evidence demonstrates that microglia contribute to neurodegeneration, as both pharmacological and genetic ablation of these cells delays disease onset, reduces gliosis, and preserves neuronal integrity. Depletion of both microglia and peripheral macrophages has an even broader therapeutic effect and abolishes major pathological hallmarks, highlighting the central role of the neuroimmune response in driving disease progression. Notably, MD patients, including LS, show neuroinflammation and broader immune aterations. In recent years, mitochondria have emerged as key regulators of immune signaling. In the context of mitochondrial dysfunction, mitochondrial nucleic acids (mtNAs) can be released into the cytosol, where they are sensed as danger signals by immune sensors. This leads to the activation of antiviral pathways, including type I interferon (IFN-I) responses. Aberrant activation of such pathways has been linked to neurodegenerative diseases and, more recently, to MD. Supporting this, previous work from our group uncovered an antiviral transcriptional signature in Ndufs4-deficient GABAergic neurons from the OB. In this thesis, we show that loss of Ndufs4 leads to a robust upregulation of antiviral and IFN-stimulated proteins in vulnerable brain regions. We demonstrate that genetic ablation of Ifnar1, which encodes for a subunit of the IFN-I receptor, partially attenuates this response and modulates microglial reactivity, but does not prevent disease progression, suggesting that IFN-I signaling is not a major driver of pathology. Furthermore, we identify the cytosolic double-stranded RNA sensor Protein Kinase R (PKR) as a key antiviral effector that contributes to disease. Postnatal knockdown of PKR significantly extends survival and reduces microgliosis. We validate PKR activation and show that it contributes to pathology through proinflammatory signaling, independently of its canonical role in inhibiting protein synthesis. Finally, we explore the neuroimmune compartment by performing bulk RNA-Seq and RNA-Seq of CD11b+ cells in several models. Transcriptomic profiling of microglia/macrophages from Ndufs4KO mice reveals that antiviral signaling occurs not only in neurons but also in CD11b+ cells. We further identify that antiviral signaling in myeloid cells is dependent on IFN-I, but that PKR upregulation in other cell-types is partially independent of IFN-I. We propose that mitochondrial dysfunction in neurons initiates an antiviral-like cascade that is further propagated and amplified by the neuroimmune compartment. Lastly, we explore the impact of intrinsic Ndufs4 deficiency in microglia by performing RNA-Seq of CD11b+ cells from neuron-specific Ndufs4 KO mice. Altogether, this thesis identifies mitochondria-elicited antiviral signaling as a novel and pathogenic event in MD. These findings broaden our understanding of how immune dysregulation contributes to neurodegeneration in MD and open new avenues for therapeutic intervention.