Cellular high-density lipoprotein-mediated cholesterol trafficking: pathophysiological mechanisms and therapeutic strategies in cardiovascular and Alzheimer’s disease

Abstract

El transport del colesterol és essencial per al manteniment de la homeòstasi cel·lular. La seva alteració s’associa amb la malaltia cardiovascular (CVD) i la malaltia d’Alzheimer (AD). Aquesta tesi comprèn tres estudis complementaris que investiguen la regulació del transport de colesterol en l’arteriosclerosi i la neurodegeneració. Tot i que els tres estudis comparteixen metodologies per avaluar l’eflux de colesterol i el transport revers de colesterol (RCT), cadascun les aplica en models cel·lulars i animals específics per abordar diferents qüestions mecanístiques. El primer estudi va examinar l’impacte de la inhibició de la proproteïna convertasa subtilisina/kexina tipus 9 (PCSK9) en la hipercolesterolèmia familiar (FH). Utilitzant mostres aparellades de pacients amb FH abans i després del tractament amb evolocumab, es va observar que la inhibició de PCSK9 no afecta l’eflux de colesterol dels macròfags. No obstant, indueix una redistribució del colesterol derivat dels macròfags, disminuint el colesterol associat a lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) i augmentant en lipoproteïnes d’alta densitat (HDL). En un model murí humanitzat de FH (ratolins heterozigots deficients del receptor LDL que expressen APOB100 humana) tractat amb anticossos contra PCSK9, es va observar un efecte similar que va donar lloc a un augment del RCT dels macròfags a causa d’un aclariment hepàtic accelerat de les LDL. Aquests resultats recolzen un efecte positiu de la inhibició de PCSK9 sobre el RCT dels macròfags, com a acció ateroprotectora addicional que transcendeix la seva capacitat de reduir el colesterol LDL en la FH. El segon estudi va investigar el metabolisme del colesterol en les cèl·lules musculars llises vasculars (VSMCs), ja que es consideren una de les principals fonts de cèl·lules escumoses que promouen l’arteriosclerosi. Es va observar que, després de la càrrega de colesterol, les VSMCs experimenten un canvi fenotípic que disminueix la seva capacitat d’eflux de colesterol i redueix el RCT. L’activació dels receptors X hepàtics (LXRs) va restaurar la capacitat d’eflux de les VSMCs carregades de colesterol i va augmentar el RCT. Així mateix, la inhibició de l’enzim acil-CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT) també va millorar aquesta capacitat, ja que prevé l’esterificació del colesterol i, per tant, incrementa la disponibilitat de colesterol lliure. La combinació de l’activació de LXRs i la inhibició d’ACAT va tenir un efecte sinèrgic que va maximitzar l’eliminació de colesterol de les VSMCs. Aquests resultats indiquen que la càrrega de colesterol indueix un fenotip de cèl·lula escumosa en VSMCs caracteritzat per un RCT defectuós, que pot ser restaurat mitjançant estratègies farmacològiques específiques. El tercer estudi es va centrar en el transport de colesterol mediat pel líquid cefaloraquidi (CSF) en la AD. Les lipoproteïnes del CSF, similars a HDL i formades principalment per APOE, faciliten el transport de colesterol des d’astròcits a neurones. Es van utilitzar mostres de CSF de pacients amb AD i controls per estudiar l’eflux de colesterol des d’astròcits, que va ser similar en ambdós grups. No obstant, les lipoproteïnes del CSF de pacients amb AD van mostrar una capacitat reduïda per transportar colesterol a les neurones. Aquest defecte no es va veure influenciat per Aβ o tau. En canvi, es va demostrar que les isoformes d’APOE juguen un paper clau: partícules reconstituïdes d’HDL que contenien APOE4 van mostrar una capacitat significativament menor d’entregar colesterol a les neurones en comparació amb les que contenien APOE3. Això destaca un mecanisme dependent d’isoforma mitjançant el qual l’APOE4 contribueix al transport alterat de colesterol en la AD. En conjunt, aquests estudis aprofundeixen en la comprensió dels mecanismes de transport de colesterol en la CVD i la AD, i subratllen la importància de reguladors moleculars com PCSK9, LXRs, ACAT i les isoformes d’APOE en la dinàmica del colesterol i la progressió d’aquestes malalties.

El transporte de colesterol es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular. Su alteración se relaciona con la enfermedad cardiovascular (CVD) y la enfermedad de Alzheimer (AD). Esta tesis comprende tres estudios complementarios que investigan la regulación del transporte de colesterol en la arteriosclerosis y la neurodegeneración. Aunque los tres estudios comparten metodologías para evaluar el eflujo de colesterol y el transporte reverso de colesterol (RCT), cada uno las aplica en modelos celulares y animales específicos para abordar diferentes cuestiones mecanísticas. El primer estudio examinó el impacto de la inhibición de la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) en la hipercolesterolemia familiar (FH). Utilizando muestras pareadas de pacientes con FH antes y después del tratamiento con evolocumab, se demostró que la inhibición de PCSK9 no afecta el eflujo de colesterol desde macrófagos. Sin embargo, induce una redistribución del colesterol derivado de macrófagos, disminuyendo el colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL) y aumentándolo en lipoproteínas de alta densidad (HDL). En un modelo murino humanizado de FH (ratones heterocigotos deficientes del receptor LDL que expresan APOB100 humana) tratado con anticuerpos contra PCSK9, se observó un efecto similar que resultó en un incremento del RCT desde macrófagos debido a un aclaramiento hepático acelerado de las LDL. Estos resultados respaldan un efecto positivo de la inhibición de PCSK9 sobre el RCT desde macrófagos, como acción ateroprotectora adicional que trasciende su capacidad de reducir el colesterol LDL en la FH. El segundo estudio investigó el metabolismo del colesterol en las células musculares lisas vasculares (VSMCs), ya que se consideran una de las principales fuentes de células espumosas que promueven la arteriosclerosis. Se observó que, tras la carga de colesterol, las VSMCs experimentan un cambio fenotípico que disminuye su capacidad de eflujo de colesterol y reduce el RCT. La activación de los receptores X hepáticos (LXRs) restauró la capacidad de eflujo de las VSMCs cargadas de colesterol y aumentó el RCT. Asimismo, la inhibición de la enzima acil-CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT) también mejoró dicha capacidad, ya que previene la esterificación del colesterol y, por consiguiente, aumenta la disponibilidad de colesterol libre. La combinación de la activación de LXRs y la inhibición de ACAT tuvo un efecto sinérgico que maximizó la eliminación de colesterol de las VSMCs. Estos hallazgos indican que la carga de colesterol induce un fenotipo de célula espumosa en VSMCs caracterizado por un RCT defectuoso, que puede ser restaurado mediante estrategias farmacológicas específicas. El tercer estudio se centró en el transporte de colesterol mediado por el líquido cefalorraquídeo (CSF) en la AD. Las lipoproteínas del CSF, similares a HDL y formadas principalmente por APOE, facilitan el transporte de colesterol desde astrocitos a neuronas. Se emplearon muestras de CSF de pacientes con AD y controles para el estudio del eflujo de colesterol desde astrocitos, el cual fue similar en ambos grupos. Sin embargo, las lipoproteínas del CSF de pacientes con AD mostraron una capacidad reducida para transportar colesterol a neuronas. Este defecto no se vio influenciado por Aβ o tau. En cambio, se demostró que las isoformas de APOE desempeñan un papel clave: partículas reconstituidas de HDL que contenían APOE4 mostraron una capacidad significativamente menor de entregar colesterol a las neuronas en comparación con aquellas con APOE3. Esto destaca un mecanismo dependiente de isoforma mediante el cual APOE4 contribuye a un transporte alterado de colesterol en AD. En conjunto, estos estudios profundizan en la comprensión de los mecanismos de transporte de colesterol en la CVD y la AD, y subrayan la importancia de reguladores moleculares como PCSK9, LXRs, ACAT y las isoformas de APOE en la dinámica del colesterol y la progresión de estas.

Cholesterol transport is a fundamental process in maintaining cellular homeostasis. Its disruption has been linked to cardiovascular disease (CVD) and Alzheimer’s disease (AD). This thesis comprises three complementary studies investigating the regulation of cholesterol trafficking in the contexts of atherosclerosis and neurodegeneration. Although the studies share methodologies to assess cholesterol efflux and reverse cholesterol transport (RCT), each work applies these approaches to disease-specific cellular and animal models, addressing distinct mechanistic pathways. The first study examines the impact of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) inhibition on cholesterol metabolism in familial hypercholesterolemia (FH). Using paired samples from FH patients before and after treatment with the PCSK9 inhibitor evolocumab, we demonstrate cholesterol efflux from macrophages was not affected following PCSK9 inhibition. However, it promotes a redistribution of macrophage-derived cholesterol by decreasing low-density lipoprotein (LDL)-associated cholesterol and increasing high-density lipoprotein (HDL)-bound cholesterol in plasma. Similar redistribution was observed in PCSK9 antibody-treated FH mice (heterozygous LDL receptor-deficient mice expressing human APOB100), resulting in enhanced macrophage-to-feces RCT due to accelerated hepatic clearance of LDL particles. These findings support a role for PCSK9 inhibition in positively modulating macrophage-specific RCT, which represents an additional atheroprotective effect beyond LDL-lowering in FH. The second study investigates cholesterol metabolism in vascular smooth muscle cells (VSMCs), which are key contributors to foam cell formation and atherogenesis. Upon cholesterol loading, VSMCs undergo a phenotypic switch that reduces their cholesterol efflux capacity, and diminishes in vivo RCT. Activation of liver X receptors (LXRs) restores cholesterol efflux from lipid-laden VSMCs and enhances RCT. Additionally, inhibition of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT) improves efflux capacity by preventing cholesterol esterification and increasing free cholesterol availability. Notably, LXR activation combined with ACAT inhibition exerts a synergistic effect that maximizes cholesterol removal from VSMCs. These results demonstrate that cholesterol loading impairs VSMC-mediated RCT, a hallmark of the foam cell-like phenotype, which can be pharmacologically restored by LXR activation and ACAT inhibition either individually or in combination. The third study focuses on cerebrospinal fluid (CSF)-mediated cholesterol transport in AD. CSF HDL-like particles, primarily composed of APOE, facilitate the delivery of astrocyte-derived cholesterol to neurons. This process is critical for membrane remodeling and myelination. Using CSF samples from AD patients and control subjects, we show that cholesterol efflux from astrocytes to CSF HDL-like particles remains unaltered in AD. However, CSF HDL-like particles from AD patients display a markedly reduced ability to deliver cholesterol to neurons. This deficit is not influenced by the presence of hallmark AD biomarkers Aβ or tau proteins. Instead, we demonstrate that APOE isoforms play a critical role: reconstituted HDL particles containing APOE4 show significantly reduced neuronal cholesterol uptake compared to those with APOE3. These findings highlight an isoform-dependent mechanism by which APOE4 contributes to impaired cholesterol delivery to neurons in AD. Together, these studies deepen our understanding of cholesterol transport mechanisms in CVD and AD. They also underscore the importance of molecular regulators, such as PCSK9, LXR and ACAT, and APOE isoforms, in modulating cholesterol dynamics and disease pathology.