Quantificació, Identificació i Tipificació de llevats mitjançant lús de diferents tècniques moleculars

Author

Hierro Crivillé, Núria

Director

Mas i Baron, Albert, 1953-

Guillamón Navarro, José Manuel

Date of defense

2007-05-24

ISBN

9788469124284

Legal Deposit

T.254-2008



Department/Institute

Universitat Rovira i Virgili. Departament de Bioquímica i Biotecnologia

Abstract

Alcoholic fermentation is a complex microbial process that is characterized by a succession of different species of yeasts. Yeasts with low fermentation activity, such as Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. and Kluyveromyces spp., are predominant in grape musts and during the early stages of fermentation. Subsequently, Saccharomyces cerevisiae proliferates, dominates and completes the wine fermentation. Non-Saccharomyces spp. can contribute to the aroma properties and chemical composition of the resulting wine. However, they can be both beneficial and harmful. For a good control of the wine making process, cellars need fast, simple and reliable methods for identifying and typing yeasts as well as for detecting and enumerating yeasts.<br/><br/>The objectives of this thesis were: (i) to develop molecular techniques for characterization, identification and quantification of wine yeasts, (ii) to evaluate the usefulness of these techniques to identify and quantify yeasts isolated from natural samples of wine fermentation. For this purpose, we used the oligonucleotides based on the repetitive extragenic palindromic (REP) and enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) elements described in bacteria to characterize reference yeast strains. We also evaluated the usefulness of the complementary primers to ISS (intron splice site) for the same objective. We also developed real-time, or quantitative, PCR (QPCR) to rapidly detect and quantify the total number of yeasts, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in wine without culturing and we also performed a reverse transcriptase QPCR (RT-QPCR) assay from rRNA for total viable yeast quantification. We later validated all these techniques with natural samples of wine.<br/>We characterized 41 reference strains belonging to 15 species by three PCR methods: PCR-ISS, ERIC-PCR and REP-PCR. We demonstrated the reproducibility of the techniques, but some problems of reproducibility were sometimes detected with the REP-PCR. The REP-PCR amplification patterns from strains of the same species were identical and some polymorphism was detected by PCR-ISS and ERIC-PCR in strains of the same species. In spite of this intraspecific variability, the strains of the same species showed enough species-specific bands to enable yeast identification. Therefore, all three techniques are useful for rapid, simple and relatively cheap yeast identification. <br/>Afterwards, we proved the usefulness of these PCR techniques to monitor yeast diversity during industrial wine fermentation. We evaluated how the growth dynamics of non-Saccharomyces yeasts is affected by new winemaking practice of cold maceration, and by grape maturity. Half of the isolates were ascribed to Candida stellata, Hanseniaspora uvarum and H. osmophila. The other isolates we identified were identified as minor species. As general conclusions we could indicate that the higher the degree of ripeness, the higher the proportion of C. stellata in the grape must. Also, it seemed that cold maceration favored the presence of H. osmophila, C. tropicalis and Z. bisporus. <br/>We also developed a QPCR assay for detecting and quantifying the total yeast population, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in a sample of wine. The QPCR assays were first conducted on reference yeast strains from pure cultures to detect the specificity of the primers. We later validated this technique with artificially contaminated and natural samples of wine and compared the results with those obtained from plating to determine effectiveness of QPCR. We obtained a very good correlation between the predicted number of cells determined by QPCR and by plating. The detection of RNA by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is considered to be a better indicator of cell viability than the detection of DNA. We compared total yeast quantification by plating and by QPCR using DNA as template with Saccharomyces cerevisiae quantification using RNA. The counts obtained by the three methods were similar.


La fermentació alcohòlica és un procés microbià complex que es caracteritza per una successió de diferents espècies de llevats. Llevats amb una baixa activitat fermentativa, com són Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. i Kluyveromyces spp., són predominants en el most i durant els primers dies de fermentació. Posteriorment, Saccharomyces cerevisiae prolifera, domina i completa la fermentació alcohòlica. Els llevats anomenats no-Saccharomyces spp. poden contribuir a les propietats aromàtiques i composició química del vi resultant. No obstant, aquests llevats poden ser tant beneficiosos com perjudicials. Per a un bon control del procés de vinificació, els cellers necessiten mètodes ràpids, senzills i fiables per a la identificació i tipificació de llevats a l'igual que per detectar i enumerar llevats.<br/>Els objectius d'aquesta tesi eren: (i) desenvolupar tècniques moleculars per a la caracterització, identificació i quantificació llevats vínics, (ii) avaluar la utilitat d'aquestes tècniques per identificar i quantificar llevats aïllats de mostres reals de fermentacions alcohòliques. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar els oligonucleòtids basats en repeticions d'elements palindròmics extragèniques (REP) i repeticions d'elements consensus entobacterials intergènics (ERIC) descrits en bacteris per caracteritzar soques de llevats de referència. També vam avaluar la utilitat dels primers complementaris a ISS (intron splice site) amb el mateix objectiu. També vam desenvolupar la PCR a temps real o PCR quantitativa (QPCR) per detectar i quantificar de manera ràpida el nombre total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en vi sense cultiu en placa i també vam realitzar la reacció de la transcriptasa inversa i posteriorment QPCR (RT-QPCR) a partir de rRNA per a la quantificació de llevats totals viables. Posteriorment, vam validar totes aquestes tècniques amb mostres reals de vi.<br/>Vam caracteritzar 41 soques de referència pertanyents a 15 espècies amb tres tècniques: PCR-ISS, ERIC-PCR i REP-PCR. Vam demostrar la reproduïbilitat de les tècniques, però amb la tècnica REP-PCR vam detectar alguns problemes de reproduïbilitat. Els patrons d'amplificació REP-PCR de soques de la mateixa espècie eren idèntics i amb la PCR-ISS i ERIC-PCR vam detectar alguns polimorfismes en soques de la mateixa espècie. Malgrat aquesta variabilitat intraespecífica, les soques de la mateixa espècie mostraven força bandes espècie-específiques que permetien la identificació del llevat. Per tant, les tres tècniques són útils per a una ràpida, senzilla i relativament barata identificació de llevats.<br/>Posteriorment, demostràrem la utilitat d'aquestes tècniques per monitoritzar la diversitat de llevats durant una vinificació industrial. Vam avaluar com la dinàmica de creixement dels llevats no-Saccharomyces spp. podia veure's afectada per la pràctica de la maceració en fred, i per el grau de maduresa del raïm. La meitat dels aïllats eren Candida stellata. Hanseniaspora uvarum i H. osmophila. Els altres aïllats eren identificats com a espècies minoritàries. Com a conclusions generals, podem indicar que<br/>com més alt el grau de maduresa, més alta la proporció de C. stellata en el most. També, sembla que la maceració en fred afavoreix la presència de H. osmophila, C. tropicalis i Z. bisporus.<br/>També vam desenvolupar la tècnica de la QPCR per detectar i quantificar la població total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en una mostra de vi. Els assaigs de QPCR eren conduits primer sobre cultius purs de soques de llevats de referència per tal de detectar l'especificitat dels primers. Més tard, validàrem aquesta tècnica amb vi contaminat artificialment i amb mostres reals de vi i comparàrem els resultats obtinguts amb aquells obtinguts per cultiu en placa per determinar l'eficàcia de la QPCR. Vam obtenir una bona correlació entre el número predit de UFC per QPCR i per plaqueig. La detecció de RNA mitjançant PCR prèvia reacció de la transcriptasa inversa (RT-PCR), es considera un millor indicador de viabilitat que la detecció de DNA. Vam comparar la quantificació dels llevats totals per plaqueig i per QPCR utilitzant DNA i utilitzant RNA. El recompte obtingut amb els tres mètodes fou similar.

Keywords

identificació i tipificació; quantificacií; llevats vínics

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics; 663/664 - Food and nutrition. Enology. Oils. Fat

Documents

TesiNuriaHierroCriville1.pdf

1.498Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)